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重组多杀性巴氏杆菌毒素的猪细胞毒性及其小鼠病理模型的建立

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农业生物技术学报 2023年第1期31卷 213-222页

作者：李金峰袁建林赵勤杜森焱伍锐文翼平黄小波颜其贵曹三杰四川农业大学动物医学院/猪病研究中心四川农业大学国家级动物类实验教学示范中心农业部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测站

多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocida toxin, PMT)作为多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)最重要的毒力因子之一，危害生猪健康，造成巨大经济损失。为鉴定重组多杀性巴氏杆菌毒素(Recombinant Pasteurella multocida toxin, r PMT)对4种猪细胞的毒性并构建其小鼠(Mus musculus)毒性病理模型。本研究构建pColdⅠ-tox A载体并可溶性表达rPMT；通过形态学观察、细胞增殖毒性(cell counting kit-8, CCK-8)检测及钙黄绿素/碘化丙啶(calcein/propidium iodide)染色探究rPMT对PK15等4种猪细胞的毒性。运用寇氏(Karber)法测定r PMT对C57BL/6J小鼠的半数致死剂量(the median lethal dose,LD50)，并对rPMT攻毒后小鼠的心、肝、脾、肺、肾、小肠进行组织病理学分析。结果显示，rPMT蛋白(146kD)表达于上清；rPMT处理4种猪细胞后，PK15细胞形态变化最明显，细胞死亡较多，细胞活性显著降低(P<0.05)，而IPEC细胞活性显著升高(P<0.05);r PMT对C57BL/6J小鼠的LD50为0.490 ng/g (rPMT/体重)；攻毒后小鼠肠绒毛脱落，肾脏、肝脏充血严重，脾脏红髓区脾窦出血、淋巴细胞数量减少并伴有大量色素沉积。本研究鉴定发现r PMT对4种猪细胞中的PK15毒性作用最大并成功构建了rPMT对C57BL/6J小鼠的毒性病理模型，为深入研究PMT的致病机制提供了理论基础。

关键词：重组多杀性巴氏杆菌毒素(PMT) 猪细胞细胞毒性小鼠病理模型

利用UPLC-DAD-HRMS分析低温压榨鲜青花椒油贮藏期间的色素变化

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中国油脂 2024年第6期49卷 145-152页

作者：刘若曦肖宇雪俸贵强章康致周纯洁蔡甜陈科伟西南大学食品科学学院重庆400715 西南大学食品科学与工程国家级实验教学示范中心重庆400715 重庆市食品药品检验检测研究院重庆401121 西南大学化学化工学院重庆400715 西南大学中匈食品科学合作中心重庆400715 川渝共建特色食品重庆市重点实验室重庆400715 农业农村部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆) 重庆400715

旨在为低温压榨鲜青花椒油的工业生产、贮藏和质量控制提供借鉴,利用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-高分辨质谱(UPLC-DAD-HRMS)技术对低温压榨鲜青花椒油中色素进行测定,并研究贮藏过程中光、氧、温度对低温压榨鲜青花椒油的色素含... 详细信息

旨在为低温压榨鲜青花椒油的工业生产、贮藏和质量控制提供借鉴,利用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-高分辨质谱(UPLC-DAD-HRMS)技术对低温压榨鲜青花椒油中色素进行测定,并研究贮藏过程中光、氧、温度对低温压榨鲜青花椒油的色素含量和色泽L^(*)、a^(*)、b^(*)的影响。结果表明:从低温压榨鲜青花椒油中鉴定出32种叶绿素和10种类胡萝卜素;叶绿素中主要含有叶绿素a、C13^(2)-羟基-叶绿素a、叶绿素b和脱镁叶绿素a;类胡萝卜素中主要含有叶黄素和β-胡萝卜素;叶绿素总量为9.44mg/kg,类胡萝卜素总量为4.95mg/kg。贮藏过程中影响低温压榨鲜青花椒油中色素降解最主要的因素是光,其次是温度,氧气几乎没有影响。另外,a^(*)可以作为衡量低温压榨鲜青花椒油色素含量及色泽控制的指标。

关键词：青花椒超高效液相色谱-二极管阵列检测器-高分辨质谱(UPLC-DAD-HRMS) 色素叶绿素类胡萝卜素色度值

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猪δ冠状病毒M蛋白的截短表达及间接ELISA方法的建立

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农业生物技术学报 2022年第2期30卷 402-412页

作者：宋代丽杨富升陈钰乔孙凡媛陈汭曹三杰黄小波四川农业大学动物医学院猪病研究中心农业农村部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站四川农业大学国家级动物类实验教学示范中心

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是一种新出现的猪(Sus scrofa)肠道致病性冠状病毒,可导致哺乳仔猪严重脱水、呕吐及水样腹泻,在全球范围内广泛分布。为建立一种快速检测PDCoV抗体的间接ELISA方法,本研究利用生物信息学... 详细信息

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是一种新出现的猪(Sus scrofa)肠道致病性冠状病毒,可导致哺乳仔猪严重脱水、呕吐及水样腹泻,在全球范围内广泛分布。为建立一种快速检测PDCoV抗体的间接ELISA方法,本研究利用生物信息学方法分析M蛋白的基因序列特性,设计并扩增PDCoV的M基因序列76～651 bp区域,与表达载体pET-32a构建重组质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coil)Transetta (DE3)进行诱导表达,获得截短表达的M蛋白(约35 kD);Western blot实验证明其与猪PDCoV阳性血清有良好的反应原性。基于纯化的重组M截短蛋白构建间接ELISA方法,确定阴阳性判定临界值为0.271。建立的ELISA方法与猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV-2)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)、猪口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Swine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)等阳性血清无交叉反应,批内和批间变异系数均小于10%;与基于PDCoV S1-CTD蛋白的间接ELISA方法的总符合率高达96%,表明该方法具备良好的特异性、敏感性、重复性及较高的符合率。用建立的ELISA方法检测2012～2018年四川部分地区收集的507份猪血清,结果显示总阳性率为49.11%,初步证明该病已在四川感染严重。本研究基于M截短蛋白构建的间接ELISA方法,为PDCoV疫病诊断和血清流行病学调查提供技术支持,对于PDCoV防控具有一定的意义。

关键词：猪δ冠状病毒(PDCoV) M蛋白截短表达间接ELISA 应用

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)RT-PCR检测方法的建立与应用

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农业生物技术学报 2018年第9期26卷 1631-1638页

作者：刘浩宇黄小波李成刘志鹏吴盈盈赵玉佳曹三杰文心田文翼平伍锐赵勤刘凤华四川农业大学动物医学院猪病研究中心农业部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站四川农业大学国家级动物类实验教学示范中心北京农学院动物科技学院

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCo V)是一种新发的冠状病毒。本研究根据PDCo V的M基因序列分析结果设计特异性引物,建立了反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测方法,确定了其最佳反应条件并进行了特异性、... 详细信息

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCo V)是一种新发的冠状病毒。本研究根据PDCo V的M基因序列分析结果设计特异性引物,建立了反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测方法,确定了其最佳反应条件并进行了特异性、灵敏性和重复性实验,同时应用该方法对四川省送检的226份临床仔猪(Sus scrofa)腹泻样品进行流行病学调查,并对人工感染PDCo V的7日龄仔猪组织器官进行了检测与分析。结果表明,建立的RT-PCR检测方法能够扩增出654 bp的M基因目的片段,其最佳退火温度为60℃,上下游引物量为1.75μL,且与猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine respiratory and reproductive syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)等无交叉反应;该方法最低可检出8.82×109IU/m L的PDCo V核酸。四川226份临床样品检测结果显示,PDCo V阳性检出率为7.1%;选取阳性样品CHN-SC2015株测定M基因,与Gen Bank已收录的28株PDCo V的M基因进行比对,其核苷酸相似性为98%100%,氨基酸相似性为99%100%;PDCo V感染仔猪具有广泛的组织嗜性,在心、肝、脾、肺、肾、大肠、回肠、空肠中均有检出。本研究建立的RT-PCR法具有简单、快速和特异等优点,可用于PDCo V的临床快速检测。

关键词：猪德尔塔冠状病毒(PDCoV) 反转录PCR M基因建立应用

1株猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备与鉴定

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微生物学通报 2020年第6期47卷 1847-1856页

作者：付嘉钰陈汭黄小波曹三杰文心田文翼平赵勤伍锐四川农业大学动物医学院猪病研究中心四川成都611130 四川农业大学国家级动物类实验教学示范中心四川成都611130 农业部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站四川成都611130

【背景】猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,主要引起以急性水样腹泻、呕吐和脱水等特征的胃肠道疾病。在PDCo V的4个结构蛋白中,核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)为高度保守的结构蛋白,在... 详细信息

【背景】猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,主要引起以急性水样腹泻、呕吐和脱水等特征的胃肠道疾病。在PDCo V的4个结构蛋白中,核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)为高度保守的结构蛋白,在病原诊断方面具有重要意义。【目的】以纯化的重组PDCo VN蛋白为抗原,制备抗N蛋白的单克隆抗体并进行特性鉴定。【方法】利用已构建的p ET-28a-N表达菌,经IPTG诱导表达获得具有免疫原性的重组N蛋白,并将纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,经3次亚克隆筛选,选取抗体效价最高的一株杂交瘤细胞注射小鼠腹腔并制备腹水单克隆抗体,利用Protein G亲和层析柱纯化。通过腹水单克隆抗体效价测定、抗体亚型鉴定、Western blot鉴定其特性;利用细胞间接免疫荧光试验、组织石蜡切片荧光试验、免疫组化、流式细胞荧光分选技术鉴定其诊断应用价值。【结果】经筛选后得到一株杂交瘤细胞命名为4E88,其腹水单克隆抗体效价为1:105,亚型为Ig G1型,轻链为κ链,Western blot试验表明该单克隆抗体与重组N蛋白和超速离心纯化的PDCo V全病毒反应形成特异性条带。此外,单克隆抗体4E88可以用于猪δ冠状病毒检测的间接免疫荧光试验、免疫组化染色和流式细胞荧光分选技术。【结论】研究获得的单克隆抗体4E88具有较好的反应性,为后续开展PDCo V鉴定、诊断和N蛋白功能研究等奠定基础。

关键词：猪δ冠状病毒 N蛋白单克隆抗体制备鉴定应用

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四川地区猪源艰难梭菌分子分型调查

微生物学通报 2021年第10期48卷 3726-3735页

作者：梁伟王博赵勤全柯吉武耀民缪昌曹三杰四川农业大学动物医学院猪病研究中心四川成都611130 四川农业大学国家级动物类实验教学示范中心四川成都611130 农业农村部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测站四川成都611130

【背景】艰难梭菌是一种重要的人畜共患肠道病原菌,可引起人和多种动物抗生素相关性腹泻或假膜性肠炎。四川作为我国主要的生猪产区,还未有猪源艰难梭菌流行病学调查的相关报道,对猪源艰难梭菌的防控及保障猪肉安全带来挑战。【目的】... 详细信息

【背景】艰难梭菌是一种重要的人畜共患肠道病原菌,可引起人和多种动物抗生素相关性腹泻或假膜性肠炎。四川作为我国主要的生猪产区,还未有猪源艰难梭菌流行病学调查的相关报道,对猪源艰难梭菌的防控及保障猪肉安全带来挑战。【目的】调查四川地区猪源艰难梭菌的感染、流行情况,并对分离出的艰难梭菌进行分子分型研究。【方法】收集来自四川生猪主要产区6个养殖场中猪的粪便标本(n=110),采用厌氧培养技术在艰难梭菌鉴别培养基上进行分离培养;采用PCR方法扩增艰难梭菌4个毒素基因(tcdA、tcdB、cdtA、cdtB)和7个管家基因(adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi),对分离株进行毒素基因分型和多位点序列分型。【结果】从110份样品中,经革兰氏染色镜检及PCR鉴定,共分离出20株艰难梭菌,分离率高达18.18%;毒素基因分型结果显示共获得3种毒素基因型,包括tcdA^(+)tcdB^(+)cdtA/cdtB^(+)(n=3)、tcdA^(+)tcdB^(+)cdtA/cdtB-(n=6)、tcdA-tcdB-cdtA/cdtB-(n=11);多位点序列分型结果显示获得5个ST型,包括ST11 (n=3)、ST3 (n=1)、ST35 (n=2)、ST36 (n=4)、ST109(n=10);进化树结果显示,所有分离株聚集为2个大群,分别为3个分支和17个分支。【结论】四川主要生猪产区猪群存在艰难梭菌感染,分离株的分子分型呈多样性,主要流行型为ST11、ST3、ST35、ST36、ST109型,并且存在ST11型高毒力菌株流行的风险。

关键词：四川地区猪艰难梭菌毒素基因分型多位点序列分型

人氨基肽酶N在猪丁型冠状病毒感染HEK293细胞中的作用

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畜牧兽医学报 2022年第5期53卷 1587-1597页

作者：赵玉佳陈汭宋代丽张路文肖黛李施倩文翼平伍锐赵勤杜森焱颜其贵文心田曹三杰黄小波四川农业大学动物医学院猪病研究中心成都611130 农业农村部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站成都611130 四川农业大学国家级动物类实验教学示范中心成都611130

以HEK293细胞为模型,探讨人氨基肽酶N(human aminopeptidase N,hAPN)在猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)入侵人源细胞中的作用。RT-qPCR/RT-PCR鉴定PDCoV在HEK293细胞上的增殖情况,再用CRISPR/Cas9技术构建敲除hAPN基因的HEK293细胞系,通过CCK-8试验验证敲除细胞和野生型细胞的细胞活性;用RT-qPCR和Western blot检测hAPN敲除和过表达对PDCoV复制的影响;进一步通过同源建模和分子对接预测PDCoV S蛋白和hAPN蛋白的结合位点。结果显示:PDCoV在感染HEK293细胞后12~36 h快速增殖,在36 h达到顶峰,在HEK293细胞上至少可传至2代;hAPN敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无明显差异,细胞敲除hAPN可显著抑制PDCoV复制,细胞过表达hAPN可促进PDCoV复制;同源建模和分子对接表明,S1蛋白可与hAPN蛋白结构域II结合,主要是S1蛋白的受体结合基序1(receptor binding motif 1,RBM1)氨基酸残基TYR^(92)、THR^(51)、THR^(48)、PHE^(16)和MET^(14)通过氢键与hAPN蛋白的氨基酸残基PHE^(490)、GLN^(531)、ARG^(528)和SER^(529)结合。hAPN在PDCoV感染人源细胞中发挥重要作用,为深入研究PDCoV的细胞入侵和跨种传播机制提供了新的理论依据。

关键词：猪丁型冠状病毒氨基肽酶N HEK293细胞复制

猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

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生物技术通报 2020年第8期36卷 104-110页

作者：陈汭付嘉钰刘浩宇李成赵玉佳胡靖飞瞿欢曹三杰文心田文翼平赵勤伍锐黄小波四川农业大学动物医学院猪病研究中心成都611130 四川农业大学国家级动物类实验教学示范中心成都611130 农业部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站成都611130

旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Wester... 详细信息

旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。

关键词：猪δ冠状病毒 N蛋白原核表达多克隆抗体

猪δ冠状病毒S1-CTD的截短表达及间接ELISA抗体方法的建立

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生物技术通报 2021年第5期37卷 273-280页

作者：瞿欢李成陈汭廖艺杰曹三杰文翼平颜其贵黄小波四川农业大学动物医学院猪病研究中心成都611130 农业农村部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站成都611130 四川农业大学国家级动物类实验教学示范中心成都611130

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种能引起仔猪呕吐、腹泻和脱水的新的猪肠道冠状病毒,表达了PDCoV的S基因抗原表位区(S1-CTD)并建立了检测抗体的间接ELISA方法。根据S基因序列设计引物,扩增含中和抗原表位的S1-CTD区... 详细信息

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种能引起仔猪呕吐、腹泻和脱水的新的猪肠道冠状病毒,表达了PDCoV的S基因抗原表位区(S1-CTD)并建立了检测抗体的间接ELISA方法。根据S基因序列设计引物,扩增含中和抗原表位的S1-CTD区(位于S基因的832-1 848 bp),构建原核表达载体pET28a-S1-CTD,表达的重组S1-CTD蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约41 kD,Western Blot证明其有良好的反应原性。以重组S1-CTD 蛋白为抗原建立间接ELISA,抗原最佳包被浓度为1μg/孔,待检血清的最佳稀释度为1∶50,阴阳性临界值为OD_(450nm)≥0.377。该ELISA检测其他8种常见猪病阳性血清无交叉反应,特异性好;批内和批间变异系数均小于10%,重复性好。ELISA与病毒中和试验的总符合率达83.3%。用建立的ELISA检测了2012-2017年四川部分猪场490份临床血清,结果显示血清中PDCoV抗体阳性率为49.18%。

关键词：猪丁型冠状病毒 S1-CTD蛋白原核表达间接ELISA