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O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒单抗制备及双抗体夹心ELISA方法的初步建立

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畜牧兽医学报 2024年第9期55卷 4012-4020页

作者：廖焕程石正旺罗俊聪王婉莹冯露周静张帆石鑫泰田宏中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000

本研究旨在纯化O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒抗原,并制备单克隆抗体,为口蹄疫新型Cathay毒株的研究提供生物材料。PEG沉淀法纯化O型口蹄疫Cathay毒株抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞,用间接ELISA方法筛选阳性... 详细信息

本研究旨在纯化O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒抗原,并制备单克隆抗体,为口蹄疫新型Cathay毒株的研究提供生物材料。PEG沉淀法纯化O型口蹄疫Cathay毒株抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞,用间接ELISA方法筛选阳性细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得2株能够稳定分泌特异性针对O型口蹄疫Cathay株病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为10E6与11C7。叠加试验表明,两株单抗的叠加率为49.45%,识别不同的抗原表位。间接ELISA和IFA试验显示,两株单抗与O型口蹄疫Cathay株病毒具有良好的反应性。单抗特异性检测结果表明,2株单抗均能特异性识别Cathay株口蹄疫病毒,不与其他口蹄疫病毒毒株交叉反应。抗体亚型鉴定结果显示,10E6单抗的轻链为Kappa链,11C7单抗的轻链为Lamda链,两株单抗重链类型均为IgG2a。结果表明,本研究成功制备了两株特异性结合O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒的单克隆抗体,两株单抗均具有良好的反应性与特异性。应用两株单抗建立O型口蹄疫Cathay病毒的双抗体夹心ELISA检测方法,该ELISA检测方法特异性、重复性和敏感性良好,为O型口蹄疫Cathay毒株的快速诊断防控与研究建立了基础。

关键词： O型口蹄疫病毒 Cathay拓扑型杂交瘤细胞单克隆抗体 ELISA

赤羽病病毒N蛋白原核表达及单克隆抗体的制备

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生物工程学报 2024年第5期40卷 1548-1558页

作者：林永玉石正旺罗俊聪朱昱茜席韬周静张帆石鑫泰王川田宏甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enz... 详细信息

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞。经3次亚克隆筛选得到两株特异性针对AKAV N蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2C9与5E9。通过ELISA、免疫印迹(Western blotting)、间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)对其进行鉴定。结果显示,成功筛选到特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体。IFA发现其与AKAV N蛋白具有良好的反应性,亚型鉴定试剂盒鉴定2C9 mAb重链为IgG2b型,轻链为κ链;5E9 mAb重链为IgG1型,轻链为κ链;ELISA检测效价均为1:4 096 000。本研究成功制备了两株特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体,为赤羽病诊断方法的开发、疾病的防控以及AKAV N蛋白功能的研究奠定了基础。

关键词：赤羽病病毒 N蛋白原核表达单克隆抗体

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口蹄疫病毒O型东南亚拓扑型抗原变异研究

中国农业科学 2024年第15期57卷 3093-3104页

作者：王莉李坤黄书伦李凤娟王省卢曾军刘在新动物疫病防控全国重点实验室/兰州大学动物医学与生物安全学院/中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃省病原生物学基础学科研究中心

【目的】O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）不断变异，易导致现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降引起免疫效果不佳，疫情零星散发。近年来，O型FMDV中SEA（东南亚）拓扑型流行活跃且不断变异，持续对口蹄疫防疫产生... 详细信息

【目的】O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）不断变异，易导致现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降引起免疫效果不佳，疫情零星散发。近年来，O型FMDV中SEA（东南亚）拓扑型流行活跃且不断变异，持续对口蹄疫防疫产生压力。系统解析O型FMDV毒株特异性抗原位点以及不同拓扑型毒株的序列差异，明确抗原变异的关键氨基酸，可为FMD抗原分子设计提供依据，为FMD防控提供指导。【方法】利用10株（SEA拓扑型）毒株特异性牛源单克隆中和抗体，对毒株O/GSLX/2010(O/Mya/98谱系)进行抗体压力筛选逃逸突变株，鉴定这10株抗体所识别表位的关键氨基酸。利用牛源多抗血清样本（32份）与逃逸突变毒株进行病毒交叉中和试验，分析SEA拓扑型毒株的免疫优势表位；通过序列比对分析不同拓扑型毒株在该抗原表位上的差异。利用反向遗传技术将差异性抗原表位引入O型FMDV经典疫苗株O/HN/CHA/93(Cathay拓扑型)，对拯救的点突变毒株测序分析后进行间接免疫荧光试验鉴定，并通过病毒蚀斑测定与一步生长曲线检测病毒的复制动力学。利用SEA拓扑型毒株特异性单克隆中和抗体，通过中和试验分析拯救突变株的抗原性，确定影响病毒抗原性的关键氨基酸，评估毒株特异性位点氨基酸的改变对抗原谱的影响。【结果】SEA拓扑型特异性抗原表位主要集中于结构蛋白VP1的B-C/C-D环，属于抗原位点3。10株抗体中多数抗体（8/10）识别的抗原表位在VP1上，其中有6株单抗（A19、B55、B74、C5、F53和F166）识别的关键氨基酸位于VP1 B-C环（T43、K45）及C-D环（P58），另外2株单抗（B66和F41）识别的关键氨基酸位于VP1 C末端。病毒交叉中和试验结果表明，VP1上43位和VP3上131位氨基酸的改变显著降低了牛源多抗血清的抗体效价。对O型FMDV不同谱系毒株（26株）序列进行分析，发现三种拓扑型毒株VP1 B-C/C-D环的28、47、56和58位氨基酸不同。利用反向遗传技术成功将毒株特异性抗原表位引入Cathay拓扑型毒株（O/HN/CHA/93），拯救出6株FMDV的点突变株：POZ-GSLX-M58、POZ-GSLX-M56/58、POZ-GSLX-M28/58、POZ-GSLX-M47/58、POZ-GSLX-M28/58/47和POZ-GSLX-M47/56/58。微量中和试验结果表明，VP1上56/58位对毒株抗原性起到关键作用；然而，进一步增加28位和47位突变会降低抗体B83的中和作用，影响毒株自身的抗原性。因此，VP1上56和58位氨基酸的改变可以扩展SEA拓扑型特异性中和mAbs对O/HN/CHA/93毒株的中和效力与广度。【结论】O型FMDV结构蛋白VP1上56和58位氨基酸是引起SEA拓扑型毒株抗原变异的关键位点，引入这些抗原决定簇可以拓展FMDV O/HN/CHA/93的抗原谱。研究为FMD防控及疫苗设计提供参考。

关键词：口蹄疫病毒毒株特异性中和抗体抗原变异

非洲猪瘟病毒D1133L蛋白增加宿主波形蛋白磷酸化而促进病毒在猪巨噬细胞中的复制

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微生物学报 2024年第3期64卷 720-732页

作者：陈玲玲张婷郝雨杨金柯史喜绢张大俊杨行赵登率闫文倩别鑫恬陈国辉郑海学乐涛张克山重庆师范大学生命科学学院重庆401331 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫沉淀-质谱联用(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MASS)技术筛选与pD1133L互作的宿主细胞蛋白,发现细胞波形蛋白(vimentin,VIM)为pD1133L互作的宿主蛋白之一,但尚不清楚宿主蛋白VIM对ASFV复制的影响。【目的】探究ASFV与VIM的相互调控作用,揭示VIM促进ASFV复制的机制。【方法】通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)试验验证pD1133L与VIM存在互作关系;外源过表达VIM蛋白以及设计并合成VIM的si RNA探究VIM对ASFV复制的影响;利用Western blotting以及荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法检测ASFV对VIM蛋白水平以及转录水平的影响;通过Western blotting、间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)探究巨噬细胞感染ASFV后VIM磷酸化水平变化以及亚细胞定位变化情况;CCK-8试剂盒检测VIM磷酸化抑制剂KN-93处理的最佳浓度,并利用Western blotting以及IFA检测KN-93对VIM磷酸化、亚细胞定位以及对ASFV复制影响。【结果】VIM过表达促进ASFV复制,敲低VIM的表达则抑制ASFV复制;ASFV感染抑制VIM蛋白水平以及转录水平表达,且呈时间依赖性;ASFV感染后VIM发生磷酸化修饰且发生亚细胞定位改变,从而促进ASFV复制。【结论】证实了ASFV与宿主蛋白VIM之间的相互调控作用;初步确定ASFV感染后VIM受到ASFV pD1133L调控,亚细胞定位发生重排向核周聚集从而促进ASFV复制的机制。

关键词：非洲猪瘟病毒 D1133L蛋白波形蛋白蛋白互作磷酸化

偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒制备及免疫原性评价

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生物工程学报 2024年

作者：张越茹毅郝荣增杨洋赵陇和李亚军杨锐卢炳州郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃农业大学动物医学院

本研究旨在利用铁蛋白制备携带非洲猪瘟病毒p30蛋白的纳米颗粒抗原，并对其免疫原性进行评价，为非洲猪瘟纳米疫苗研究提供实验基础。首先，将编码p30蛋白和Spytag标签的基因序列融合后插入pCold-I载体，得到pCold-p30质粒。将编码S... 详细信息

本研究旨在利用铁蛋白制备携带非洲猪瘟病毒p30蛋白的纳米颗粒抗原，并对其免疫原性进行评价，为非洲猪瘟纳米疫苗研究提供实验基础。首先，将编码p30蛋白和Spytag标签的基因序列融合后插入pCold-I载体，得到pCold-p30质粒。将编码Spycatcher与铁蛋白的基因序列融合后插入pET-28a（+）载体，得到pET-F-np质粒，并分别在大肠杆菌中诱导表达。然后，将亲和层析纯化后的p30蛋白与铁蛋白在体外偶联结合，用分子筛纯化后得到偶联p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒F-p30，利用粒径仪、透射电镜观察形态结构。将F-p30纳米颗粒蛋白免疫小鼠，评估其体液和细胞免疫应答。试验结果表明，本研究成功制备出偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒，颗粒结构约20 nm。F-p30在体外能被小鼠骨髓源树突状细胞（bone marrow derived cells， BMDC）高效摄取，与p30蛋白相比， F-p30纳米颗粒免疫小鼠诱导产生更高水平的特异性抗体和细胞因子，更有利于刺激淋巴结滤泡辅助T细胞(follicular helper T cell， TFH)、生发中心B细胞（germinal center B cells， GCB）和脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞的增殖。综上，本研究成功制备了偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白的铁蛋白纳米颗粒，能显著增强p30蛋白的免疫原性，有助于非洲猪瘟疫苗的研究。

关键词：非洲猪瘟 p30蛋白铁蛋白纳米颗粒免疫原性

绵羊肺炎支原体GH3-3株全基因组测序及生物信息学分析

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生物技术通报 2024年第7期40卷 323-334页

作者：田彤彤葛家振高鹏程李学瑞宋国栋郑福英储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

【目的】全面了解绵羊肺炎支原体GH3-3株的基因序列,研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制。【方法】采用体外培养,利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组DNA,进行全基因组测序。【结果】绵... 详细信息

【目的】全面了解绵羊肺炎支原体GH3-3株的基因序列,研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制。【方法】采用体外培养,利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组DNA,进行全基因组测序。【结果】绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组大小为1060772 bp,GC含量为29.66%,基因组组分分析后发现,GH3-3株的基因组含有730个编码基因,总长度为914379 bp,平均长度为1252.57 bp,占基因组全长的86.2%。串联重复序列共149个,总长为20926 bp,占基因组全长的1.97%。微卫星DNA序列102个,tRNA 30个,rRNA 3个。在NR、SwissProt、GOG、KEGG、GO、CARD、CAZy、PHI、TCDB、RMS数据库中,分别有719、459、473、394、449、33、5、180、113、59个基因被注释;在VFDB数据库中,共注释到了76个毒力因子相关的基因。将基因组序列提交至NCBI网站,获得登录号为:PRJNA1051969。【结论】获得了绵羊肺炎支原体GH3-3株完整的基因组信息,预测和注释了其基因的功能,明确了GH3-3株以及与国内外其他绵羊肺炎支原体菌株之间的遗传进化关系。

关键词：绵羊肺炎支原体 GH3-3株全基因组测序毒力因子耐药基因

口蹄疫病毒与塞内卡病毒灭活抗原免疫小鼠脾脏的转录组学差异分析

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生物工程学报 2024年

作者：郑紫萱马雪青李坤孙普黄书伦董开恒赵琼琼卢曾军钱平华中农业大学动物医学院农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室国家口蹄疫参考实验室

本研究旨在探究C57BL/6小鼠免疫口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）与塞内卡病毒（Senecavirus A，SVA）2种病原的免疫应答差异，为解析获得性免疫调控机制提供理论基础。将灭活纯化的FMDV与SVA抗原分别免疫C57BL/6小鼠... 详细信息

本研究旨在探究C57BL/6小鼠免疫口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）与塞内卡病毒（Senecavirus A，SVA）2种病原的免疫应答差异，为解析获得性免疫调控机制提供理论基础。将灭活纯化的FMDV与SVA抗原分别免疫C57BL/6小鼠，设置PBS免疫对照组；利用流式细胞术分析免疫后14、28 d各组小鼠脾淋巴细胞中Th1与Th2细胞的比例，并进行小鼠脾脏转录组测序和分析；通过体外抗原刺激鼠巨噬细胞验证筛选差异基因的表达。结果显示，小鼠免疫后14 d，FMDV与SVA抗原免疫组诱导Th1/Th2型免疫应答水平无显著差异，免疫后28 d，SVA抗原免疫组诱导Th1型与Th2型免疫应答水平均高于FMDV抗原免疫组；转录组测序获得2种抗原免疫后2组共有差异基因Rsad2和Tspan8等，可能参与FMDV和SVA抗原激活Th1/Th2型免疫应答反应的过程；FMDV与SVA抗原体外刺激巨噬细胞分泌IL-12、IL-33，差异基因Tspan8、Rsad2的表达趋势同转录组测序结果一致，Rsad2的表达受I型干扰素（IFNα、IFNβ）的调控。本研究获得小鼠脾脏中2种抗原免疫应答相关差异基因，为进一步研究FMDV和SVA免疫应答机制奠定重要的分子基础。

关键词：口蹄疫病毒 A型塞内卡病毒 Th1/Th2型免疫应答脾脏转录组测序

细胞自噬相关蛋白ATG9A对口蹄疫病毒侵入的影响

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中国兽医科学 2024年第3期54卷 285-291页

作者：邓欣雨袁红王涛宫晓华赵俊芳包慧芳李平花孙普付元芳李坤刘在新卢曾军白兴文中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为揭示细胞自噬相关蛋白9A(ATG9A)对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,利用IFA、RT-qPCR和Western-blot等方法检测FMDV与ATG9A的共定位情况以及病毒感染对ATG9A的影响;通过构建ATG9A重组表达质粒和合成小干扰RNA,检测过表达及敲降ATG9A对FMD... 详细信息

为揭示细胞自噬相关蛋白9A(ATG9A)对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,利用IFA、RT-qPCR和Western-blot等方法检测FMDV与ATG9A的共定位情况以及病毒感染对ATG9A的影响;通过构建ATG9A重组表达质粒和合成小干扰RNA,检测过表达及敲降ATG9A对FMDV吸附、内化、基因组复制、蛋白翻译、子代病毒粒子产生的影响。结果显示,FMDV感染后与ATG9A共定位且抑制ATG9A的表达;ATG9A不影响FMDV的吸附,但极显著地抑制FMDV的内化过程;同时,过表达(或干扰)ATG9A能够在RNA与蛋白水平显著降低(或提高)FMDV的增殖和子代病毒粒子产生的能力。结论,ATG9A抑制FMDV的复制,为深入认识FMDV在细胞内的复制周期提供了线索。

关键词：自噬相关蛋白9A 口蹄疫病毒内化复制

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益生菌细菌素防御病毒和细菌感染的机制研究

中国兽医科学 2024年第6期54卷 808-815页

作者：李彩玉刘东慧权衡周继章陈启伟宫晓炜中国农业科学院、兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

面对抗生素耐药性的巨大挑战,益生菌细菌素在提高免疫力和抗感染方面展现了显著的效果。基于此,开发以益生菌细菌素为基础的新型抗菌剂成为研究的热点。本文对益生菌细菌素的来源、分类以及它对病毒和细菌的作用机理和应用进行综述,旨... 详细信息

面对抗生素耐药性的巨大挑战,益生菌细菌素在提高免疫力和抗感染方面展现了显著的效果。基于此,开发以益生菌细菌素为基础的新型抗菌剂成为研究的热点。本文对益生菌细菌素的来源、分类以及它对病毒和细菌的作用机理和应用进行综述,旨在为天然产物的筛选和新型替抗产品的研发提供参考。

关键词：益生菌细菌素病毒细菌