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痘苗病毒天坛株F1L区高效重组方法的建立

病毒学报 2022年第4期38卷 791-798页

作者：袁航任皎赵莉豆亚美田厚文王文玲谭文杰中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206

痘苗病毒是一种在细胞质中复制的DNA病毒,曾作为天花疫苗在消除天花的过程中起着重要作用。近年来,随着分子生物学的发展,痘苗病毒作为基因表达载体,被广泛应用于疫苗研发、肿瘤治疗等不同方面。研究者们通过自然选择或基因工程技术减... 详细信息

痘苗病毒是一种在细胞质中复制的DNA病毒,曾作为天花疫苗在消除天花的过程中起着重要作用。近年来,随着分子生物学的发展,痘苗病毒作为基因表达载体,被广泛应用于疫苗研发、肿瘤治疗等不同方面。研究者们通过自然选择或基因工程技术减毒获得了复制缺陷型痘苗病毒,除了国际上广泛使用的MVA和NYVAC以外,国内还有非复制型痘苗病毒天坛株(NTV)。由于NTV缺失了多种宿主范围基因,导致其免疫原性低下,因此仍须对其进行基因改造以获得更好的疫苗载体。目前改造方法主要是同源重组,但是传统同源重组方法的重组率很低,限制了痘苗病毒载体疫苗载体的研发。近年来随着CRISPR/Cas9技术的发展,使得建立基于CRISPR/Cas9的高效重组体系成为可能。痘苗病毒目前的研究热点主要集中在抗凋亡基因上。有实验表明,抗凋亡基因F1L的缺失在不影响痘苗病毒的复制能力的同时,还降低了毒力,改善了CD8+T细胞免疫反应水平,提高了作为疫苗载体的安全性。这些发现表明该基因的缺失是优化痘苗病毒的有效策略之一。本研究设计了痘苗病毒F1L区重组质粒,通过运用CRISPR/Cas9技术,对TTV的F1L基因进行缺失重组。经重组病毒的噬斑纯化与PCR、Western Blot验证后,证明了该重组系统的有效性与正确性。我们建立了痘苗病毒F1L区高效重组技术方法并筛选出最佳的gRNA。这为后续NTV的改造提供了更多基因靶点选择。

关键词：痘苗病毒 CRISPR/Cas9 F1L 病毒载体

表达人乳头瘤病毒16型E6/E7融合蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建及免疫效果观察

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病毒学报 2006年第5期22卷 358-363页

作者：田厚文任皎黄薇范江涛赵莉阮力中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052

采用基因工程方法将HPV16E6、E7基因融合后插入痘苗病毒载体,通过同源重组构建表达人乳头瘤病毒16型E6/E7融合蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗,用C57BL/6小鼠观察其免疫原性和抗肿瘤移植情况。测序结果表明融合的HPV16E6、E7基因序列与... 详细信息

采用基因工程方法将HPV16E6、E7基因融合后插入痘苗病毒载体,通过同源重组构建表达人乳头瘤病毒16型E6/E7融合蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗,用C57BL/6小鼠观察其免疫原性和抗肿瘤移植情况。测序结果表明融合的HPV16E6、E7基因序列与设计相符;构建的非复制型重组痘苗病毒经Dot blot鉴定,显示有E6、E7融合基因的插入;Western blot检测表明该重组病毒在鸡胚成纤维细胞中能表达HPV16型E6/E7融合蛋白。动物免疫试验表明,该重组病毒在小鼠体内可诱发E6、E7特异性抗体;被免疫小鼠能抵抗TC-1肿瘤细胞的攻击。此结果为将来进一步研制HPV16、18型联合疫苗打下了基础。

关键词：乳多空病毒科人乳头状瘤病毒16型宫颈肿瘤疫苗早期蛋白

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创新性艾滋病疫苗研究

中华微生物学和免疫学杂志 2013年第1期33卷 19-23页

作者：刘颖洪坤学邵一鸣中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心北京102206

人免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）因自然感染无有效保护性免疫和其基因的高变异性，使艾滋病疫苗研制面临着巨大的科学和技术挑战。如何诱导针对HIV感染的保护性免疫应答，特别是广谱性中和抗体和T细胞免疫应答，是... 详细信息

人免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）因自然感染无有效保护性免疫和其基因的高变异性，使艾滋病疫苗研制面临着巨大的科学和技术挑战。如何诱导针对HIV感染的保护性免疫应答，特别是广谱性中和抗体和T细胞免疫应答，是艾滋病疫苗研发需要突破的关键技术。

关键词：艾滋病疫苗保护性免疫应答人免疫缺陷病毒 T细胞免疫应答 HIV感染高变异性自然感染中和抗体

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冠状病毒反向遗传操作技术及其应用进展

中国生物工程杂志 2015年第2期35卷 84-91页

作者：申梁谭文杰中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒应急技术中心北京102206

冠状病毒广泛存于自然界中,人和多种动物均易感。虽然冠状病毒具有相对严格的宿主特异性,但是其广泛的宿主性及其自身基因组的结构特性使得该病毒在进化过程中极易发生基因重组和突变,新型冠状病毒在此过程中不断出现。近年来,反向遗传... 详细信息

冠状病毒广泛存于自然界中,人和多种动物均易感。虽然冠状病毒具有相对严格的宿主特异性,但是其广泛的宿主性及其自身基因组的结构特性使得该病毒在进化过程中极易发生基因重组和突变,新型冠状病毒在此过程中不断出现。近年来,反向遗传学技术的发展为冠状病毒跨种属传播及致病机制、疫苗以及抗病毒药物的研发开辟了新的思路。对冠状病毒反向遗传操作技术的进展及其应用现状进行了简要综述与展望。

关键词：冠状病毒反向遗传学技术应用

中国南方四省区流行的HIV-1 CRF01_AE病毒株基因特征研究

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中华流行病学杂志 2009年第7期30卷 720-725页

作者：程春林冯毅何翔林鹏梁淑家易志强贺健梅胡园园邢辉范雁吴士良邵一鸣中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心传染病预防控制国家重点实验室北京100050 广东省疾病预防控制中心广西壮族自治区疾病预防控制中心江西省疾病预防控制中心湖南省疾病预防控制中心苏州大学医学部生物化学教研室

目的分析中国南方四省区HIV-1感染者中流行CRF01_AE病毒株的遗传特征。方法从广东、广西、江西和湖南省（自治区）2006年新报告HIV-1感染者的血浆样本中提取病毒RNA，用反转录／巢式PCR方法扩增gag和env基因片段，对获得的CRF01_AE病毒... 详细信息

目的分析中国南方四省区HIV-1感染者中流行CRF01_AE病毒株的遗传特征。方法从广东、广西、江西和湖南省（自治区）2006年新报告HIV-1感染者的血浆样本中提取病毒RNA，用反转录／巢式PCR方法扩增gag和env基因片段，对获得的CRF01_AE病毒株核酸序列进行系统进化分析，并通过计算基因距离和Entropy核苷酸多态性差异方法分析毒株的遗传特征。结果从210例CRF01_AE病毒株感染者中，发现四省区流行的CRF01_AE病毒株存在2个主要的流行簇。流行簇Ⅰ共有123例样本，未发现与之直接相关的国际参考毒株。流行簇Ⅱ共有57例样本，与越南CRF01AE病毒株关系密切，且存在不同时间样本的混杂。gag和env基因遗传距离分析结果表明，流行簇Ⅰ内基因遗传多样性均明显小于流行簇Ⅱ；核苷酸多态性分析结果显示，在gag基因片段42个位点核苷酸组成具有显著差异，env基因片段40个位点核苷酸组成存在显著差异；流行簇Ⅰ相对于流行簇Ⅱ多态性减少的位点上有61个，多态性增加的位点有21个。结论在中国南方四省区流行的CRF01_AE病毒株中首次观察到2个独立的流行簇。流行簇I病毒株为该地区最主要的CRF01_AE病毒株，其流行时间相对较短，在人群中所占比例较多，可能是病毒在流行过程中形成的具有传播优势的病毒株。流行簇Ⅱ病毒与来自于越南的CRF01_AE病毒株有较高同源性，且存在与越南病毒株问的多次传播。

关键词：病毒株 HIV-1 CRFOI_AE 流行簇进化分析

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免疫抑制剂抗病毒作用研究进展

中国感染控制杂志 2024年第9期23卷 1184-1191页

作者：冯茜莉杨宣叶胡欣妍高明阳吴玉湖马忠仁周建华西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室甘肃兰州730010 西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730010

免疫抑制剂主要用于降低实体器官移植后发生的排斥反应,从而提高器官移植的成功率。然而,免疫抑制剂长期使用也会严重影响患者机体的免疫功能,进而增加患者感染病毒类疾病以及术后并发症导致移植失败的风险。因此,患者需要在服用免疫抑... 详细信息

免疫抑制剂主要用于降低实体器官移植后发生的排斥反应,从而提高器官移植的成功率。然而,免疫抑制剂长期使用也会严重影响患者机体的免疫功能,进而增加患者感染病毒类疾病以及术后并发症导致移植失败的风险。因此,患者需要在服用免疫抑制剂的同时也服用抗病毒药物。若发现一些具有抗病毒效果的免疫抑制剂,将大大减轻患者服用药物的负担。目前,具有抗病毒效果的免疫抑制剂已被研究人员关注。这些免疫抑制剂抗病毒机制的逐步揭示,有助于优化器官移植受者术后康复的治疗方案。基于机体对移植器官产生排异反应的机制,本文系统阐述了与器官移植患者感染密切相关的病毒种类以及一些免疫抑制剂在抗病毒方面的分子机制,进一步为临床上预防和治疗器官移植引发病毒性感染提供新的思路。

关键词：实体器官移植排斥反应免疫抑制剂抗病毒机制

3型哺乳动物正呼肠孤病毒SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2024年第8期46卷 819-824页

作者：汤文菲罗宇航董覃婷朱鑫玥王杨林韦祖樟陈樱欧阳康覃一峰钟舒红谢江陈集成王小玲黄伟坚潘艳广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 广西农业职业技术大学广西南宁530007 广西壮族自治区兽医研究所广西南宁530001 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心广西南宁530004 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室广西南宁530004 广西高校动物疫病预防与控制重点实验室广西南宁530004

哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)是双链RNA病毒,可以感染自然宿主的哺乳动物和脊椎动物。为建立一种针对3型哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV-3)的特异且快速的检测方法,本研究根据Genbank登录的MRV-3(OQ627746-OQ627755)S1基因保守区设计1对特异性... 详细信息

哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)是双链RNA病毒,可以感染自然宿主的哺乳动物和脊椎动物。为建立一种针对3型哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV-3)的特异且快速的检测方法,本研究根据Genbank登录的MRV-3(OQ627746-OQ627755)S1基因保守区设计1对特异性引物,并从MRV-3中扩增S1基因,构建重组质粒p MD18-S1,经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品,经反应体系及反应条件优化后首次初步建立了检测MRV-3的SYBR Green I荧光定量PCR(q PCR)方法。将质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板经该q PCR扩增,建立标准曲线,结果显示,质粒标准品在1.3×10^(8)拷贝/μL~1.3×10^(3)拷贝/μL与各自的Ct值均呈良好的线性关系,斜率为-3.1706,R^(2)为0.9999,熔解曲线为单峰。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、水牛匈爱病毒(Buf Hu V)、牛冠状病毒(BCo V)、牛细小病毒(BPV)和MRV-3的基因组DNA/c DNA为模板,利用本研究建立的q PCR方法检测,评估该方法的特异性;将质粒标准品10倍倍比稀释至1.3×10^(2)拷贝/μL~1.3×10^(8)拷贝/μL后作为模板,分别利用本研究建立的q PCR和常规PCR检测,比较两种方法的检测结果,评估本研究建立q PCR方法的敏感性;以1.3×10^(3)拷贝/μL~1.3×10^(7)拷贝/μL 5个不同浓度的质粒标准品为模板,利用该方法分别进行批内和批间的重复性试验,评估该方法的重复性。结果显示,该方法只能检测出MRV-3,其他相关病原的检测结果均为阴性;该q PCR对质粒标准品的检测限为1.3×10^(3)拷贝/μL,比常规PCR敏感性高10 000倍;批内和批间重复性试验的变异系数均小于或等于1.0%,表明该q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好。利用该方法检测220份牛粪便样品,结果显示MRV-3的检出率(3.64%,8/220)高于常规PCR的检出率(1.36%,3/220),两种检测方法的阳性符合率达100%,阴性符合率为97.75%,总符合率为97.78%。综上所述,本研究首次建立的检测MRV-3的SYBR Green I q PCR方法可以用于临床牛腹泻病原的检测,为MRV-3尤其是牛源MRV-3提供了一种快速灵敏的检测手段,也为MRV-3的后续研究奠定了基础。

关键词：哺乳动物正呼肠孤病毒 SYBR Green I 荧光定量PCR 病毒检测

H5N1-NP蛋白的原核表达及与宿主蛋白相互作用的初步研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2010年第1期24卷 27-29页

作者：王乃福马晶张晓光张晓梅白天王敏温乐英王大燕舒跃龙周玲曾毅中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京100052 北京工业大学生命科学与生物工程学院中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心

目的原核表达并纯化禽流感病毒A/Anhui/1/2005（H5N1）的NP蛋白,并筛选人支气管上皮BEAS-2B细胞总蛋白中能够与纯化的NP蛋白相互作用的蛋白.方法一方面,构建了含有NP基因的原核表达质粒pET30a-NP,并在大肠埃希菌中获得了可溶性表达.... 详细信息

目的原核表达并纯化禽流感病毒A/Anhui/1/2005（H5N1）的NP蛋白,并筛选人支气管上皮BEAS-2B细胞总蛋白中能够与纯化的NP蛋白相互作用的蛋白.方法一方面,构建了含有NP基因的原核表达质粒pET30a-NP,并在大肠埃希菌中获得了可溶性表达.亲和层析和离子交换层析两步对NP蛋白进行纯化.另一方面,制备了BEAS-2B细胞总蛋白.在此基础上,联合应用Pull-down与LC-MS/MS技术来筛选并确认细胞中与纯化的NP蛋白相互作用的成分.结果构建的pET30a-NP质粒在IPTG诱导下在原核细胞中实现了可溶表达,经过两步纯化后,得到可溶的NP蛋白纯品.Pull-down与LC-MS/MS技术初步筛选到BEAS-2B细胞中20个可能与NP蛋白相互作用的细胞蛋白.还需要进一步的实验来验证他们和NP蛋白之间的相互作用.结论获得了高纯度的可溶NP蛋白及筛选到20个可能与其相互作用的BEAS-2B细胞候选蛋白.

关键词：流感病毒A型核蛋白类蛋白质相互作用

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营养与人体免疫:古老和永恒的研究主题

中华医学杂志 2020年第46期100卷 3657-3658页

作者：赵文华中国疾病预防控制中心营养与健康所北京100050

营养与人体免疫一直是营养学研究的一个主题。新型冠状病毒肺炎疫情暴发后,营养与免疫更是受到前所未有的广泛关注。在过去的45年中,营养与人体免疫的相关研究仍以欧美等发达国家为主,而我国的研究不仅起步时间晚,也缺乏系统性。希望"... 详细信息

营养与人体免疫一直是营养学研究的一个主题。新型冠状病毒肺炎疫情暴发后,营养与免疫更是受到前所未有的广泛关注。在过去的45年中,营养与人体免疫的相关研究仍以欧美等发达国家为主,而我国的研究不仅起步时间晚,也缺乏系统性。希望"膳食营养对人体免疫功能影响的研究方法""营养对人体免疫功能的影响""膳食模式对人体免疫功能的影响"以及"营养对炎症因子或氧化应激等人体免疫相关生物标记物的影响"4篇系统综述能为我国未来的科学研究,特别是就营养素、膳食模式与炎症/氧化应激标记物等人体免疫相关生物标记物的关系,以及对慢性病的发病机制研究方面起到参考和推动作用。

关键词：营养人体免疫回顾展望