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基于福尔马林固定法的大鼠肝微核实验方法的建立与验证

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中国药理学与毒理学杂志 2024年

作者：赵田田何伟伟周长慧赵泽浩杨紫轩常艳中国医药工业研究总院上海益诺思生物技术股份有限公司

目的建立和验证基于福尔马林固定肝组织制备肝细胞(福尔马林固定法)的大鼠肝微核实验(LMNT)方法。方法 (1)使用肝微核阳性化合物N-亚硝基二乙胺(DEN)建立基于福尔马林固定法的LMNT。SD大鼠根据性别分为雌性和雄性组，然后分别随机分为... 详细信息

目的建立和验证基于福尔马林固定肝组织制备肝细胞(福尔马林固定法)的大鼠肝微核实验(LMNT)方法。方法 (1)使用肝微核阳性化合物N-亚硝基二乙胺(DEN)建立基于福尔马林固定法的LMNT。SD大鼠根据性别分为雌性和雄性组，然后分别随机分为溶剂对照组和DEN 12.5 mg·kg-1组，每组5只。分别ig给予生理盐水和DEN，每天1次，连续14 d后取肝组织。部分组织用胶原酶消化法制备肝细胞悬液，其余组织用福尔马林固定法制备肝细胞悬液。肝细胞经SYBR Gold染色后显微镜检微核化肝细胞数量和处于有丝分裂期肝细胞数，分别计算肝细胞微核率和有丝分裂指数，肝细胞微核率>0.07%判定为阳性结果。(2)雄性SD大鼠分为喹啉(30,60,120 mg·kg-1)组、N-亚硝基吡咯烷(NPYR,25,50,100 mg·kg-1)组、各自溶剂对照组(NPYR，去离子水；喹啉，玉米油)及阳性对照DEN组，每组5～6只，连续ig 15 d。每日记录体重，实验结束取肝记录肝总重，采用基本胶原酶消化法和福尔马林固定法的LMNT测定肝细胞微核率，开展肝彗星实验和外周血MN实验评价喹啉和NPYR遗传毒性。结果(1)与各自溶剂对照组的肝细胞微核率(0.069%和0.030%)相比，DEN的基于福尔马林固定法的LMNT测得的雄性大鼠肝细胞微核率为1.10%，雌性大鼠肝细胞微核率为0.82%，均显著升高(P<0.05)；与各自溶剂对照组(0.060%和0.030%)相比，DEN的基于胶原酶消化法的LMNT测得的雄性大鼠肝细胞微核率为1.45%，雌性大鼠肝细胞微核率为0.46%，均显著升高(P<0.05)，判定为阳性。2种方法中雄性大鼠的肝细胞微核率均显著高于雌性(P<0.05)。与各自溶剂对照组相比，基于胶原酶消化法和基于福尔马林固定法的LMNT测得的DEN组雄性和雌性大鼠的有丝分裂指数均无明显差异。(2) NPYR基于福尔马林固定法的LMNT测得的肝细胞微核率结果较胶基于原酶消化法的LMNT略高，均判定为阳性；与溶剂对照组相比，NPYR基于福尔马林固定法和基于胶原酶消化法的LMNT测得的肝细胞微核率均显著增加(P<0.05)；喹啉基于福尔马林固定法的LMNT测得的肝细胞微核率结果与基于胶原酶消化法的结果相当，均判定为阳性；与溶剂对照组相比，喹啉基于福尔马林固定法和基于胶原酶消化法的LMNT测得的肝细胞微核率均显著增加(P<0.05)。NPYR和喹啉基于福尔马林固定法与基于胶原酶消化法的LMNT所测得的肝细胞微核率相关性较好(R2分别为0.8614和0.9279)。NPYR彗星实验结果为阳性，外周血MN实验为阴性；喹啉彗星实验和外周血MN实验结果均为阴性。结论初步建立并验证了基于福尔马林固定法的大鼠LMNT方法，且基于福尔马林固定法的LMNT方法检测肝致癌物的灵敏度≥基于胶原酶消化法的LMNT方法。

关键词：肝微核实验福尔马林固定法胶原酶消化法

循环miR⁃124作为铅神经毒性标志物的灵敏性、稳定性和组织特异性研究

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南京医科大学学报（自然科学版） 2024年第2期44卷 154-161页

作者：周慧王雁李华汪溪洁陈华英马璟中国医药工业研究总院上海益诺思生物技术股份有限公司上海201203

目的:验证循环微小核糖核酸(microRNA,miRNA)⁃124的稳定性、组织特异性及其检测铅神经毒性的灵敏性,为循环miR⁃124用于铅神经毒性评价提供依据。方法:采用Zea⁃Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型,采集血液样本离心、分装后立即检测... 详细信息

目的:验证循环微小核糖核酸(microRNA,miRNA)⁃124的稳定性、组织特异性及其检测铅神经毒性的灵敏性,为循环miR⁃124用于铅神经毒性评价提供依据。方法:采用Zea⁃Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型,采集血液样本离心、分装后立即检测或在室温、2~8℃和-70~-90℃条件下储存不同时间后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real⁃time polymerase chain reaction,RT⁃qPCR)检测miR⁃124的表达;分别使用对乙酰氨基酚(1250 mg/kg)、异丙肾上腺素(2.5 mg/kg)和庆大霉素(80 mg/kg)建立大鼠肝毒性、心脏毒性和肾毒性模型,采集血液样本检测并比较造模前后循环miR⁃124的变化;使用醋酸铅(300、600 mg/kg)建立大鼠神经毒性模型,采用酶联免疫吸附测定方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测白细胞介素(interleukin,IL)⁃10、IL⁃1β和肿瘤坏死因子⁃α(tumor necrosis factorα,TNF⁃α)的变化,比较检测到细胞因子和循环miR⁃124含量变化的时间评估其灵敏性。结果:以新鲜血液样本作为对照,血液样本室温保存6 h,2~8℃保存24 h,-70~-90℃保存36 d以及3次冻融后循环miR⁃124仍保持稳定,稳定性可以支持实验室需求;循环miR⁃124在大鼠肝毒性、心脏毒性和肾毒性模型中均无明显改变,具有良好的组织特异性;与细胞因子相比,循环miR⁃124可以更灵敏地检测铅暴露引起的神经炎症。结论:循环miR⁃124具有良好的稳定性、组织特异性和灵敏性,可作为评价铅神经毒性的潜在的生物标志物。

关键词：循环miR⁃124 生物标志物验证灵敏性稳定性组织特异性

基于4%中性甲醛固定肝组织的大鼠肝微核实验方法的建立与验证

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中国药理学与毒理学杂志 2024年第6期38卷 436-444页

作者：赵田田何伟伟周长慧赵泽浩杨紫轩常艳中国医药工业研究总院上海益诺思生物技术股份有限公司上海201203

目的建立并验证基于4%中性甲醛固定肝组织制备肝细胞的大鼠肝微核实验(LMNT)方法(甲醛固定-LMNT法)。方法(1)SD大鼠分为雌性和雄性组,然后分别随机分为溶剂对照组和肝微核阳性化合物N-亚硝基二乙胺(DEN)12.5 mg·kg^(-1)组,每组5只,分... 详细信息

目的建立并验证基于4%中性甲醛固定肝组织制备肝细胞的大鼠肝微核实验(LMNT)方法(甲醛固定-LMNT法)。方法(1)SD大鼠分为雌性和雄性组,然后分别随机分为溶剂对照组和肝微核阳性化合物N-亚硝基二乙胺(DEN)12.5 mg·kg^(-1)组,每组5只,分别ig给予生理盐水和DEN,每天1次,连续14 d后取肝组织,同时用胶原酶消化-LMNT法和甲醛固定-LMNT法检测微核化肝细胞数量和处于有丝分裂期肝细胞数,分别计算肝细胞微核率和有丝分裂指数,肝细胞微核率>0.07%判定为阳性结果。(2)雄性SD大鼠分为喹啉(30,60和120 mg·kg^(-1))组、N-亚硝基吡咯烷(NPYR,25,50和100 mg·kg^(-1))组、各自溶剂对照组(NPYR,去离子水;喹啉,玉米油)及阳性对照DEN(12.5 mg·kg^(-1))组,每组5~6只,连续ig 15 d。每日记录体重,实验结束取肝记录肝总重,计算肝系数。自动生化分析仪检测肝功能相关血清生化指标谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性和血清总胆红素(T-BIL)、直接胆红素(D-BIL)的水平。采用胶原酶消化-LMNT法和甲醛固定-LMNT法测定肝细胞微核率,用外周血微核实验和肝彗星实验评价喹啉和NPYR遗传毒性。结果(1)与各自溶剂对照组的肝细胞微核率(0.069%和0.030%)相比,甲醛固定-LMNT法测得的DEN组雄性大鼠肝细胞微核率为1.10%,雌性大鼠为0.82%,均显著升高(P<0.05);与各自溶剂对照组(0.060%和0.030%)相比,胶原酶消化法-LMNT法测得的DEN组雄性大鼠肝细胞微核率为1.45%,雌性大鼠为0.46%,均显著升高(P<0.05),判定为阳性。2种方法中雄性大鼠的肝细胞微核率均显著高于雌性(P<0.05)。与各自溶剂对照组相比,2种方法测得的DEN组雄性和雌性大鼠肝细胞有丝分裂指数均无明显差异。(2)与溶剂对照组相比,NPYR 50和100 mg·kg^(-1)组大鼠体重在ig第7~14天显著降低(P<0.01),DEN组在ig第8~14天显著降低(P<0.01);喹啉120 mg·kg^(-1)组大鼠在ig第4~14天显著降低(P<0.01),DEN组在ig第10~14天显著降低(P<0.05)。与溶剂对照组相比,NPYR 100 mg·kg^(-1)组(P<0.01)和DEN组(P<0.05)的肝重和肝系数均显著降低;喹啉60和120 mg·kg^(-1)组肝重(P<0.01)和肝系数(P<0.05)均显著增加。与溶剂对照组相比,DEN组大鼠血清T-BIL水平显著升高(P<0.01),NPYR 100 mg·kg^(-1)组GPT、GOT活性和D-BIL、T-BIL水平均显著升高(P<0.01),NPYR 25,50 mg·kg^(-1)和喹啉各剂量组则均无显著差异。甲醛固定-LMNT法测得的NPYR组肝细胞微核率较胶原酶消化-LMNT法略高,均判定为阳性;与溶剂对照组相比,2种方法测得的NPYR组肝细胞微核率均显著增加(P<0.05),喹啉组结果相当,均判定为阳性;2种方法测得的喹啉组肝细胞微核率均显著增加(P<0.05)。2种方法测得的NPYR和喹啉组肝细胞微核率相关性较好(R2分别为0.8614和0.9279)。NPYR组外周血微核实验为阴性,彗星实验结果为阳性;喹啉组外周血微核实验和彗星实验结果均为阴性。结论初步建立并验证了甲醛固定-LMNT法,且该方法检测肝致癌物的灵敏度与胶原酶-LMNT法相近。

关键词：肝微核实验甲醛固定胶原酶消化

毒性病理学及人工智能数字组织图像分析质量控制概述

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中国新药杂志 2024年第5期33卷 441-448页

作者：滕伊洋张亚群李一昊钱庄汪溪洁吕建军中国医药工业研究总院上海201203 上海益诺思生物技术股份有限公司上海200043 益诺思生物技术南通有限公司南通226133 湖北天勤鑫圣生物科技有限公司武汉430207

随着人工智能和机器学习的快速发展,人工智能对全切片图像的诊断几乎可以媲美病理学家,建立人工智能算法需要大量的数字组织图像训练集数据。数字组织图像分析是通过各种算法分析全切片图像,并从其中提取大量复杂的定量数据集。数字组... 详细信息

随着人工智能和机器学习的快速发展,人工智能对全切片图像的诊断几乎可以媲美病理学家,建立人工智能算法需要大量的数字组织图像训练集数据。数字组织图像分析是通过各种算法分析全切片图像,并从其中提取大量复杂的定量数据集。数字组织图像分析的质量控制不仅非常重要,而且是确保建立高质量数据集和AI算法的基础和前提。本文简要概述了全切片图像的质量控制策略、数字组织图像分析的影响因素和质量控制方法、数字组织图像分析结果的质量控制方法、毒性病理学家在数字组织图像分析中的作用、数据解释和报告以及数字组织图像用于毒性病理学诊断及AI的挑战,以期为我国药物非临床安全性评价毒性试验中使用全切片图像进行毒性病理学诊断及建立AI各种算法提供一定参考。

关键词：毒性病理学人工智能数字组织图像分析质量控制全切片图像

乌头碱运动神经毒性及miR-124作为其潜在毒性标志物的探索研究

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世界临床药物 2024年第6期45卷 583-589页

作者：周慧杨鑫汪溪洁马璟中国医药工业研究总院上海201203 上海益诺思生物技术股份有限公司上海201203

目的研究循环微RNA(microRNA,miR)-124成为乌头碱运动神经毒性标志物的潜力。方法将42只大鼠随机分为对照组、乌头碱0.025 mg/kg(低剂量)组及0.05 mg/kg(高剂量)组,每组14只,静脉注射给药14 d。采用功能观察组合检测运动行为改变;观察... 详细信息

目的研究循环微RNA(microRNA,miR)-124成为乌头碱运动神经毒性标志物的潜力。方法将42只大鼠随机分为对照组、乌头碱0.025 mg/kg(低剂量)组及0.05 mg/kg(高剂量)组,每组14只,静脉注射给药14 d。采用功能观察组合检测运动行为改变;观察脑组织病理和检测脑细胞凋亡;采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测脑和血液miR-124表达;采用酶联免疫吸附试验检测血液神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的含量。结果与对照组相比,低剂量组给药D14后、高剂量组给药D1和D14后出现移笼较容易、头部或躯体运动减少以及反射减弱等运动行为改变(P<0.05);高剂量组见大脑纹状体坏死和胶质细胞异常增生;低、高剂量组小脑颗粒细胞层和大脑皮层细胞凋亡增加,脑组织miR-124表达增加(P<0.01)。D1给药后1 h,高剂量组循环miR-124的升高最早(P<0.01);D1给药后8 h,高剂量组循环NSE及GFAP水平升高最早(P<0.01)。结论与循环NSE和GFAP相比,高剂量组循环miR-124更早出现升高,具有检测乌头碱运动神经毒性的潜力。

关键词：乌头碱运动神经毒性标志物神经元特异性烯醇化酶胶质纤维酸性蛋白微RNA-124

恒河猴血清中预存抗AAV8衣壳总抗体检测方法的建立与确认

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中国医药工业杂志 2024年第6期55卷 851-859,865页

作者：霍一凡徐嘉辰黄美晴王国凤邱云良中国医药工业研究总院上海201203 上海益诺思生物技术股份有限公司上海201203

随着基于腺相关病毒(AAV)基因治疗的显著发展,一项重要的任务是开发简便、快速且可靠的检测AAV预存抗体的方法。该研究基于酶联免疫吸附试验(ELISA),将AAV8衣壳包被于96孔板,采用重组蛋白A/G为检测抗体,建立了一种简单、快速检测恒河猴... 详细信息

随着基于腺相关病毒(AAV)基因治疗的显著发展,一项重要的任务是开发简便、快速且可靠的检测AAV预存抗体的方法。该研究基于酶联免疫吸附试验(ELISA),将AAV8衣壳包被于96孔板,采用重组蛋白A/G为检测抗体,建立了一种简单、快速检测恒河猴血清中抗AAV8衣壳总抗体(TAb)的方法,并对其进行方法学验证。结果表明,该方法的乘法校正因子为1.08,确证临界值为29.5%;筛选和确证灵敏度分别为43.1、76.5 ng/mL。1000、100、50 ng/mL的阳性对照抗体可耐受AAV8滴度分别为1.25×1010、3.13×10~9、1.56×10~9 GC/mL。批内、批间变异系数(CV)≤20.0%。此外,本方法有足够的选择性和样本稳定性,可用于恒河猴血清中预存抗AAV8衣壳TAb的检测。

关键词： AAV8 免疫原性预存抗体总抗体 ELISA

单笼和配对饲养对食蟹猴血液学和血清生化、行为学和免疫应激的影响

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实验动物科学 2024年第1期41卷 33-38页

作者：赵琪刘永涛汪溪洁兰艳丽余珍斌龚华李彩云上海益诺思生物技术股份有限公司上海201203 中国医药工业研究总院上海201203

目的考察食蟹猴单笼和配对饲养对于动物的血液学和血生化、行为学和免疫应激指标的影响。方法取约3岁食蟹猴,雌雄各4只,分别单笼和同性别配对饲养后,于适应期、单笼饲养第14天和第21天、配对饲养第14天和第21天采集动物血样进行血液... 详细信息

目的考察食蟹猴单笼和配对饲养对于动物的血液学和血生化、行为学和免疫应激指标的影响。方法取约3岁食蟹猴,雌雄各4只,分别单笼和同性别配对饲养后,于适应期、单笼饲养第14天和第21天、配对饲养第14天和第21天采集动物血样进行血液学、血清生化和免疫应激指标检测;于单笼饲养第14~21天和配对饲养第14~21天进行行为学观察。结果单笼和配对饲养食蟹猴的血液学和免疫应激指标均无明显差异;血清生化方面,与基础值比较食蟹猴配对饲养后的总胆红素(TBIL)有显著性降低,单笼饲养时的乳酸脱氢酶(LDH)降低明显;配对饲养后食蟹猴的正常行为和积极行为分别增加了27.93%和86.10%,异常行为减少26.31%。结论单笼饲养和配对饲养对食蟹猴的血液学及免疫应激指标无明显影响;单笼饲养时动物LDH降低,配对饲养时动物TBIL降低,但均在正常背景值范围内;配对的饲养方式能有效改善食蟹猴的异常行为,提高动物福利。

关键词：食蟹猴单笼饲养配对饲养行为学应激血液学生化

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猴椅保定训练对恒河猴应激的影响

实验动物科学 2024年第2期41卷 74-77页

作者：赵琪刘永涛周超兰艳丽汪溪洁李彩云上海益诺思生物技术股份有限公司上海201203 中国医药工业研究总院上海201203

目的考察恒河猴猴椅保定30 min连续5次适应性对应激激素水平的影响。方法约3岁恒河猴,雌雄各15只,分3组,每组10只,雌雄各半进行猴椅保定适应性训练,每间隔1 d训练1次,每次训练30 min。组1:不进行适应性训练组,组2:单纯适应性训练组,组3... 详细信息

目的考察恒河猴猴椅保定30 min连续5次适应性对应激激素水平的影响。方法约3岁恒河猴,雌雄各15只,分3组,每组10只,雌雄各半进行猴椅保定适应性训练,每间隔1 d训练1次,每次训练30 min。组1:不进行适应性训练组,组2:单纯适应性训练组,组3:给予零食和安抚训练组。共训练5次,每次训练结束对3组所有动物采血分析。结果与组1相比,组2和组3在多次猴椅保定适应性训练后可见猴血清皮质酮(CROT)显著性降低(P<0.05或P<0.01),组3的猴β-内啡肽(β-EP)显著降低(P<0.05或P<0.01),组3于第1和第5次适应性训练后5-羟色胺(5-HT)升高(P<0.01)。结论进行猴椅保定的适应性训练能显著降低恒河猴的应激压力,让动物趋于习惯或适应坐猴椅保定的操作。在适应性训练中,给予正向强化的训练方式让受试者在减少应激和攻击性表现更显著,适应性保定训练3~4次就可以让应激压力降到恒定水平。

关键词：非人灵长类保定应激皮质酮内啡肽 5-羟色胺

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青光眼与偏头痛相关性概述

世界临床药物 2024年第5期45卷 555-560页

作者：赵晓东张亚群孟永熊亚妮李华中国医药工业研究总院上海201203 上海益诺思生物技术股份有限公司上海201203 益诺思生物技术南通有限公司江苏南通226133

青光眼(glaucoma)是一种不可逆性的神经退行性致盲眼病,严重危害患者身心健康和生活质量。青光眼发病时常伴头痛等症状,而偏头痛(migraine)的相关视觉检查结果也与青光眼相似,在病理生理方面二者都存在血管危险因素。偏头痛是否只是青... 详细信息

青光眼(glaucoma)是一种不可逆性的神经退行性致盲眼病,严重危害患者身心健康和生活质量。青光眼发病时常伴头痛等症状,而偏头痛(migraine)的相关视觉检查结果也与青光眼相似,在病理生理方面二者都存在血管危险因素。偏头痛是否只是青光眼患者的伴随病症,或者其本身就是青光眼的危险因素,目前仍存在争议。为更好地阐明青光眼与偏头痛之间的临床相关性,该文对青光眼与偏头痛在流行病学、病理生理学的相关性以及临床相似处等方面进行综述,以期为后续研究提供参考。

关键词：青光眼偏头痛视觉障碍临床诊断