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羊口疮病毒基因组结构及重要基因功能研究进展

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畜牧与兽医 2024年第9期56卷 142-151页

作者：张江绒田谦王艳华周洛译孙跃峰王光祥中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

羊口疮是由羊口疮病毒(orf virus, ORFV)引起的一种人畜共患疾病,具有接触性、嗜上皮性和自限性的特征,该疾病在全球范围内广泛流行,严重影响公共卫生,对养羊业也造成不可忽视的经济损失。本文主要综述了国内外在羊口疮病原学、基因组... 详细信息

羊口疮是由羊口疮病毒(orf virus, ORFV)引起的一种人畜共患疾病,具有接触性、嗜上皮性和自限性的特征,该疾病在全球范围内广泛流行,严重影响公共卫生,对养羊业也造成不可忽视的经济损失。本文主要综述了国内外在羊口疮病原学、基因组结构以及功能基因等方面的研究进展,旨在为相关学者提供研究参考。通过对病毒基因组及其功能基因的深入解析,不仅有助于深入理解病毒的致病机理和宿主的互作机制,同时也为疫苗的研发提供理论依据。

关键词：羊口疮羊口疮病毒功能基因

展示口蹄疫病毒优势中和表位的铁蛋白纳米颗粒制备及其在小鼠模型上的免疫原性评价

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农业生物技术学报 2024年第5期32卷 1216-1226页

作者：卢炳州茹毅郝荣增李亚军杨洋杨锐毛玉涵蒋成辉陶世宇郑海学余四九崔燕甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室

蛋白纳米颗粒能够在表面展现多拷贝抗原，模拟病毒的结构形态，更有利于免疫细胞摄取和促进抗原递呈，从而增强疫苗保护效力。本研究旨在利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统制备展示口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV... 详细信息

蛋白纳米颗粒能够在表面展现多拷贝抗原，模拟病毒的结构形态，更有利于免疫细胞摄取和促进抗原递呈，从而增强疫苗保护效力。本研究旨在利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统制备展示口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)优势中和表位的铁蛋白纳米颗粒，并评估其免疫原性。首先以幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)铁蛋白序列为基础，将FMDV优势中和表位序列插入铁蛋白第33和34位氨基酸之间，同时将耶尔森氏菌属(Yersinia) T细胞表位序列插入铁蛋白氨基酸序列的氨基末端，构建具有铁蛋白序列、B细胞表位(优势中和表位)和T细胞表位的重组表达质粒pET28a-FBT，以仅插入铁蛋白序列的重组质粒pET28a-Fer作为对照。将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，经诱导表达和分子筛层析纯化获得目的蛋白，利用SDS-PAGE、Western blot、粒径分析和透射电镜进行鉴定，进一步免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)评价免疫原性。结果显示，利用大肠杆菌表达系统成功制备的铁蛋白纳米颗粒FBT可与FMDV阳性血清发生特异性反应；FBT免疫14 d即产生血清抗体，并持续升高，在免疫35 d中和抗体效价最高可达1∶128；同时，FBT免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖水平和白介素2 (interleukin 2, IL-2)、IL-4、IL-10、干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)分泌水平显著高于对照组(P研究制备了展示FMDV中和表位且具有良好免疫原性的铁蛋白纳米颗粒，为新型口蹄疫基因工程疫苗的研制提供技术支持。

关键词：铁蛋白纳米颗粒口蹄疫病毒(FMDV) 中和表位 T细胞表位免疫原性

猪圆环病毒2型LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2024年第6期54卷 728-734页

作者：毛首会杜国玉刘晓波吴锦艳兰喜何继军尚佑军王桂琴刘永杰中国农业科学院、兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州1730046 宁夏大学农学院宁夏银川750021

本研究旨在建立一种快速、准确且易于操作的猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)检测方法。首先以PCV2的ORF2基因作为靶基因,设计4条LAMP与5条CRISPR特异性引物,再分别优化获得LAMP反应体系和CRISPR检测体系中各成分最佳配比浓度... 详细信息

本研究旨在建立一种快速、准确且易于操作的猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)检测方法。首先以PCV2的ORF2基因作为靶基因,设计4条LAMP与5条CRISPR特异性引物,再分别优化获得LAMP反应体系和CRISPR检测体系中各成分最佳配比浓度,经过特异性、灵敏度、重复性以及符合性验证,最终建立了快速检测PCV2的LAMP-CRISPR/Cas12a方法。结果显示,该方法最小检测量接近1 copy质粒DNA,灵敏度远高于本实验室常用的PCR方法,且在相同条件下只有PCV2呈阳性结果,其他均呈现阴性,表明特异性良好。同时该方法具有良好的重复性,批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,该方法与qPCR之间的符合率较高,可通过肉眼观察在蓝光下的反应产物判断结果。结果表明,建立的LAMP-CRISPR/Cas12a体系适用于PCV2的快速检测。

关键词：猪圆环病毒2型 CRISPR/Cas12a检测环介导等温扩增

南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白单抗的制备与特性研究

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病毒学报 2024年第4期40卷 794-801页

作者：朱昱茜石正旺罗俊聪陈婕林永玉席韬张帆石鑫泰郑海学包世俊田宏甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730000

为制备南非2型口蹄疫病毒型特异性单克隆抗体,本研究通过原核系统表达南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白,亲和层析的方法纯化目的蛋白。将纯化的VP1蛋白使用弗氏佐剂乳化后,免疫BALB/c小鼠,待加强免疫后取血清效价最稳定的小鼠脾细胞与小鼠骨髓... 详细信息

为制备南非2型口蹄疫病毒型特异性单克隆抗体,本研究通过原核系统表达南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白,亲和层析的方法纯化目的蛋白。将纯化的VP1蛋白使用弗氏佐剂乳化后,免疫BALB/c小鼠,待加强免疫后取血清效价最稳定的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合,应用间接ELISA筛选针对南非2型VP1蛋白的单克隆抗体。采用特异性试验、叠加试验和抗体亚型鉴定等方法对筛选的单克隆抗体特性进行分析。结果发现,本研究成功表达南非2型VP1蛋白,筛选出2株能稳定分泌特异性针对南非2型VP1蛋白的杂交瘤细胞株(3B2和6F2),其亚型分别为IgG2a和IgG1,叠加试验结果表明2株单抗的叠加系数>40%,说明两株单抗针对不同的抗原位点;单抗的效价可达1∶256000,特异性试验证明2株单抗均不与O型、A型口蹄疫病毒及其他常见猪病病毒产生交叉反应。由此可见,本研究制备的单克隆抗体具有良好的特异性和反应性,为南非2型口蹄疫病毒定型诊断和未来疫苗的研制奠定了基础。

关键词：南非2型口蹄疫病毒 VP1蛋白特异性单克隆抗体

基于猪细小病毒6型VP1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

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农业生物技术学报 2024年第6期32卷 1462-1470页

作者：欧云文潘琴汪洋代军飞任绍科张洋张杰开江县动物疫病预防控制中心中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室

猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6, PPV6)是一种新发现的猪细小病毒，可导致猪(Sus scrofa)出现繁殖障碍，严重威胁养猪业健康发展。为建立一种检测PPV6抗体的间接ELISA方法，本研究以PPV6流行毒株高度保守的病毒颗粒蛋白(virio... 详细信息

猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6, PPV6)是一种新发现的猪细小病毒，可导致猪(Sus scrofa)出现繁殖障碍，严重威胁养猪业健康发展。为建立一种检测PPV6抗体的间接ELISA方法，本研究以PPV6流行毒株高度保守的病毒颗粒蛋白(virion protein, VP1)(348～675 aa)的编码基因为目标片段，构建原核表达载体pET30a-PPV6-VP1，转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)感受态细胞，IPTG诱导表达，进行Ni-NTA树脂亲和层析纯化，获得具有良好的反应原性的重组VP1蛋白，大小约为40 k D。基于纯化的重组VP1蛋白建立间接ELISA抗体检测方法，优化出最佳抗原包被浓度为1 ng/μL，待检血清最佳稀释比例为1∶100,HRP-兔抗猪IgG稀释比例为1∶60 000，阳性临界值OD450>0.62。该间接ELISA检测方法与猪蓝耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)、PPV1阳性猪血清均不发生交叉反应，敏感度达1∶3 200，批内变异系数和批间变异系数均中国西部地区部分省份收集的452份猪血清进行检测，结果显示样品阳性率为5.31%，表明该病在我国西部地区存在不同程度的感染。本研究成功截短表达了PPV6 VP1 (348～675 aa)蛋白，建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PPV6间接ELISA方法，为PPV6的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。

关键词：猪细小病毒6型(PPV6) VP1蛋白截短表达 ELISA

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口蹄疫病毒O型东南亚拓扑型抗原变异研究

中国农业科学 2024年第15期57卷 3093-3104页

作者：王莉李坤黄书伦李凤娟王省卢曾军刘在新动物疫病防控全国重点实验室/兰州大学动物医学与生物安全学院/中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃省病原生物学基础学科研究中心

【目的】O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）不断变异，易导致现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降引起免疫效果不佳，疫情零星散发。近年来，O型FMDV中SEA（东南亚）拓扑型流行活跃且不断变异，持续对口蹄疫防疫产生... 详细信息

【目的】O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）不断变异，易导致现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降引起免疫效果不佳，疫情零星散发。近年来，O型FMDV中SEA（东南亚）拓扑型流行活跃且不断变异，持续对口蹄疫防疫产生压力。系统解析O型FMDV毒株特异性抗原位点以及不同拓扑型毒株的序列差异，明确抗原变异的关键氨基酸，可为FMD抗原分子设计提供依据，为FMD防控提供指导。【方法】利用10株（SEA拓扑型）毒株特异性牛源单克隆中和抗体，对毒株O/GSLX/2010(O/Mya/98谱系)进行抗体压力筛选逃逸突变株，鉴定这10株抗体所识别表位的关键氨基酸。利用牛源多抗血清样本（32份）与逃逸突变毒株进行病毒交叉中和试验，分析SEA拓扑型毒株的免疫优势表位；通过序列比对分析不同拓扑型毒株在该抗原表位上的差异。利用反向遗传技术将差异性抗原表位引入O型FMDV经典疫苗株O/HN/CHA/93(Cathay拓扑型)，对拯救的点突变毒株测序分析后进行间接免疫荧光试验鉴定，并通过病毒蚀斑测定与一步生长曲线检测病毒的复制动力学。利用SEA拓扑型毒株特异性单克隆中和抗体，通过中和试验分析拯救突变株的抗原性，确定影响病毒抗原性的关键氨基酸，评估毒株特异性位点氨基酸的改变对抗原谱的影响。【结果】SEA拓扑型特异性抗原表位主要集中于结构蛋白VP1的B-C/C-D环，属于抗原位点3。10株抗体中多数抗体（8/10）识别的抗原表位在VP1上，其中有6株单抗（A19、B55、B74、C5、F53和F166）识别的关键氨基酸位于VP1 B-C环（T43、K45）及C-D环（P58），另外2株单抗（B66和F41）识别的关键氨基酸位于VP1 C末端。病毒交叉中和试验结果表明，VP1上43位和VP3上131位氨基酸的改变显著降低了牛源多抗血清的抗体效价。对O型FMDV不同谱系毒株（26株）序列进行分析，发现三种拓扑型毒株VP1 B-C/C-D环的28、47、56和58位氨基酸不同。利用反向遗传技术成功将毒株特异性抗原表位引入Cathay拓扑型毒株（O/HN/CHA/93），拯救出6株FMDV的点突变株：POZ-GSLX-M58、POZ-GSLX-M56/58、POZ-GSLX-M28/58、POZ-GSLX-M47/58、POZ-GSLX-M28/58/47和POZ-GSLX-M47/56/58。微量中和试验结果表明，VP1上56/58位对毒株抗原性起到关键作用；然而，进一步增加28位和47位突变会降低抗体B83的中和作用，影响毒株自身的抗原性。因此，VP1上56和58位氨基酸的改变可以扩展SEA拓扑型特异性中和mAbs对O/HN/CHA/93毒株的中和效力与广度。【结论】O型FMDV结构蛋白VP1上56和58位氨基酸是引起SEA拓扑型毒株抗原变异的关键位点，引入这些抗原决定簇可以拓展FMDV O/HN/CHA/93的抗原谱。研究为FMD防控及疫苗设计提供参考。

关键词：口蹄疫病毒毒株特异性中和抗体抗原变异

猴痘Ⅰ型毒株疫情流行新态势及其公共卫生风险应对策略与建议

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病毒学报 2024年

作者：景伟何小兵房永祥陈国华高真贞张亚岭苏洋郭慧琛景志忠中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心农业农村部兽医公共卫生重点实验室(兰州)

猴痘（Monkeypox,Mpox）是由猴痘病毒（Mpox virus,MPXV）感染引起的一种以发热、皮疹和淋巴结肿大为特征的病毒性人兽共患病，现被WHO第二次认定为构成“全球关注的突发公共卫生事件”。2022-Mpox疫情主要由MPXV进化支Ⅱ毒株B1谱系，... 详细信息

猴痘（Monkeypox,Mpox）是由猴痘病毒（Mpox virus,MPXV）感染引起的一种以发热、皮疹和淋巴结肿大为特征的病毒性人兽共患病，现被WHO第二次认定为构成“全球关注的突发公共卫生事件”。2022-Mpox疫情主要由MPXV进化支Ⅱ毒株B1谱系，通过男-男性行为接触方式主要在欧美等地区的人际间流行，但已于2023年5月解除了危机状态。然而，由MPXV进化支Ⅰb毒株谱系自2023年9月前后在刚果民主共和国等非洲地区多个国家大规模暴发流行，并在非洲地区之外的瑞典、泰国等国家首次发现相应的输入病例。由于MPXV进化支Ⅰ型毒株毒力比Ⅱ型更强，致死率更高，传播方式更多，人们担心该疫情可跨国、跨洲际传播，可对全球造成巨大危害和威胁。本文重点通过猴痘Ⅰ型毒株疫情在刚果民主共和国的暴发流行态势、临床特征以及流行毒株遗传演化适应人际间传播关键点的介绍，以期为我国新一波猴痘防控和公共卫生风险提出预警和应对依据。

关键词：猴痘猴痘病毒进化支Ⅰ型毒株流行特征公共卫生风险防控策略

环形泰勒虫亚端粒编码可变分泌蛋白家族部分基因的研究进展

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中国兽医杂志 2024年第1期60卷 87-93页

作者：李志刘军龙张学勇付永朵红郭志宏青海大学青海省畜牧兽医科学院省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室青海省动物疫病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室青海西宁810016 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

环形泰勒虫作为一种转化型泰勒虫,可感染牛单核巨噬细胞,并使其发生转化。目前,仅知环形泰勒虫通过劫持宿主细胞信号通路完成转化,但其转化机制尚未阐明。环形泰勒虫亚端粒编码可变分泌蛋白(SVSP)家族作为环形泰勒虫基因组的最大多基因... 详细信息

环形泰勒虫作为一种转化型泰勒虫,可感染牛单核巨噬细胞,并使其发生转化。目前,仅知环形泰勒虫通过劫持宿主细胞信号通路完成转化,但其转化机制尚未阐明。环形泰勒虫亚端粒编码可变分泌蛋白(SVSP)家族作为环形泰勒虫基因组的最大多基因家族,其在虫体-宿主相互作用中的功能尚不清楚。因此,本文通过对环形泰勒虫SVSP家族中部分基因的结构、表达特征、与宿主相互作用和可能发挥的功能进行总结,以期为环形泰勒虫-宿主相互作用机制和致病机理研究提供思路,同时也为癌症基础生物学研究提供借鉴。

关键词：环形泰勒虫转化亚端粒编码可变分泌蛋白相互作用

基于大肠杆菌表达系统高效生产外源蛋白的自诱导培养基的研发

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中国兽医科学 2024年

作者：侯茁邵军军刘伟高闪电彭德财宁小雨马云云温升辉常惠芸中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控国家重点实验室OIE/国家口蹄疫参考实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

为提高大肠杆菌生产抗原的产量，实现企业降本增效，加快口蹄疫多表位疫苗的产业化进程，本研究拟研发适合大肠杆菌表达系统高效表达重组蛋白的自诱导培养基，并以实验室构建的口蹄疫多表位重组表达质粒为试验对象，通过正交试验、优化... 详细信息

为提高大肠杆菌生产抗原的产量，实现企业降本增效，加快口蹄疫多表位疫苗的产业化进程，本研究拟研发适合大肠杆菌表达系统高效表达重组蛋白的自诱导培养基，并以实验室构建的口蹄疫多表位重组表达质粒为试验对象，通过正交试验、优化诱导温度、筛选和确定最佳自诱导培养基配伍。结果显示，在16℃诱导培养，自诱导培养基表达可溶性蛋白的产量为普通LB培养基的6倍，而成本却降低了78%。这说明我们成功研发出了适合原核表达系统的自诱导培养基，其良好的成本效益性价比将有助于生物制品生产企业降低成本，提高产品的竞争力，具有广阔应用前景的产品。

关键词：大肠杆菌表达自诱导培养基乳糖