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临床肺炎克雷伯菌的异质性耐药研究进展

微生物学通报 2024年第7期51卷 2326-2336页

作者：史梦兰李文茹谢小保广东省科学院微生物研究所、华南应用微生物国家重点实验室、农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室、农业农村部农业微生物组学重点实验室、广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070 浙江海洋大学国家海洋设施养殖工程技术研究中心浙江舟山316022

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是临床引起感染的常见病原菌之一,常引发肺炎、尿路感染和细菌血症等。近年来,肺炎克雷伯菌的异质性耐药相关研究相继被报道。异质性耐药是指同一菌株中同时存在对某种抗生素耐药和敏感亚群的现象,... 详细信息

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是临床引起感染的常见病原菌之一,常引发肺炎、尿路感染和细菌血症等。近年来,肺炎克雷伯菌的异质性耐药相关研究相继被报道。异质性耐药是指同一菌株中同时存在对某种抗生素耐药和敏感亚群的现象,由于其表型和遗传不稳定,至今尚无标准、低成本和高效的检测方法。本文对肺炎克雷伯菌异质性耐药进行综述,阐明了异质性耐药的定义和检测方法,并结合本团队在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)异质性耐药方面的研究工作,深入剖析了肺炎克雷伯菌的异质性耐药机制。本文为全面了解肺炎克雷伯菌异质性耐药机制、优化临床抗菌药物的使用和治疗肺炎克雷伯菌感染提供参考。

关键词：肺炎克雷伯菌异质性耐药抗生素

基于转化相关重组克隆曲酸合成基因簇及其在黑曲霉中的异源整合表达

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微生物学通报 2024年第10期 4028-4042页

作者：赵宇欣谭宇洋高莹朱柏松张明怡曹威天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间... 详细信息

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间的映射关系尚未被解析。【目的】开发一种适配黑曲霉的大片段DNA分子直接克隆的方法。以直接克隆米曲霉来源的曲酸合成基因簇(约30 kb)在黑曲霉底盘细胞中表达，实现曲酸的异源发酵。【方法】基于转化相关重组(transformation-associated recombination， TAR)克隆，构建适配黑曲霉转化的TAR捕获骨架载体pSEA-TAR；将曲酸合成基因簇上下游各1 kb同源DNA序列先后引入pSEA-TAR，中间以唯一的XhoⅠ相隔，得到曲酸合成基因簇捕获载体pSEA-KLR；随后，将NotⅠ/SbfⅠ消化后含有完整曲酸合成基因簇及上下游同源序列的米曲霉基因组与经XhoⅠ线性化的pSEA-KLR共同转化酿酒酵母VL6-48，通过营养缺陷筛选，获得成功捕获曲酸合成基因簇的重组子，提取质粒，电转化大肠杆菌扩增重组质粒；借助农杆菌介导黑曲霉转化，对获得的含有曲酸合成基因簇的黑曲霉转化子进行曲酸发酵，检测曲酸合成水平。【结果】获得了含有ARSH4/CEN6、TRP1、hph和LB/RB-T-DNA repeat的基于TAR克隆、适配黑曲霉表达的大片段DNA捕获载体pSEA-TAR。借助酿酒酵母高效的同源重组系统，通过同源重组获得含有曲酸合成基因簇的重组质粒pSEA-TAR-KA，捕获成功率为5.9%。对获得的含有曲酸合成基因簇的10株黑曲霉重组菌株KA1-KA10进行发酵分析发现均成功合成了曲酸，其中黑曲霉KA-2发酵7 d后曲酸水平最高，达到5.86 g/L。【结论】构建了适配黑曲霉的TAR克隆体系，用于大片段DNA高效捕获、重构和表达大型生物合成基因簇。以来源于米曲霉的曲酸合成基因簇捕获及在黑曲霉中成功实现曲酸合成验证了其有效性，进一步丰富了黑曲霉作为底盘细胞在重要化合物绿色生物制造中的作用。

关键词：转化相关重组(TAR)克隆大片段DNA 黑曲霉曲酸合成基因簇

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定点饱和突变提高赭曲霉11α羟化酶的催化性能

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生物技术通报 2024年第1期40卷 322-331页

作者：史京辉陈文慧陆坤郑婷婷任志远鲍国庆王敏骆健美工业发酵微生物教育部重点实验室(天津科技大学) 天津市工业微生物重点实验室天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心天津科技大学生物工程学院天津300457

【目的】11α,17α-双羟基黄体酮是重要的甾体激素类药物中间体,应用价值大。赭曲霉(Aspergillus ochraceus)CICC 41473的11α羟化酶CYP68J5是转化17α-羟基黄体酮生成11α,17α-双羟基黄体酮的关键酶,但其催化性能有待于提升。【方法... 详细信息

【目的】11α,17α-双羟基黄体酮是重要的甾体激素类药物中间体,应用价值大。赭曲霉(Aspergillus ochraceus)CICC 41473的11α羟化酶CYP68J5是转化17α-羟基黄体酮生成11α,17α-双羟基黄体酮的关键酶,但其催化性能有待于提升。【方法】在课题组前期确定的关键氨基酸位点D118、F216和M488基础上,通过定点饱和突变和底物转化实验进行优良突变体的筛选;使用AutoDock进行酶与底物的分子对接,并通过Discovery Studio和Gromacs分别研究分子间相互作用力和分子动力学模拟。【结果】突变体D118V、F216W、M488L和M488W具有催化性能,其中,优良突变体D118V的活性最高,其在底物浓度0.5 g/L时,生产强度为431.66 mg/(L·d),较野生型提高了2.12倍,这可能是因为当118位的天冬氨酸突变为缬氨酸后,该位点与底物之间产生了新的疏水相互作用,增强了酶的底物结合口袋的疏水性。分子动力学模拟结果表明酶的整体构象更稳定,酶与底物的结合更紧密。【结论】通过定点饱和突变获得了催化性能显著提升的优良突变体D118V,研究结果为甾体11α羟化酶的改造提供了应用案例和理论指导。

关键词： 11α,17α-双羟基黄体酮 11α羟化酶定点饱和突变分子对接分子动力学模拟

解脂耶氏酵母细胞工厂生产多不饱和脂肪酸的研究进展

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生物技术通报 2024年第1期40卷 72-85页

作者：何思成张紫瑗韩雨晴苗琳张翠英于爱群天津科技大学生物工程学院省部共建食品营养与安全国家重点实验室工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室天津300457

多不饱和脂肪酸属直链脂肪酸,是机体生物膜的关键结构组分,它可以调控糖脂代谢及激素代谢,具有促进发育、提高免疫力和预防疾病等多种益生功能,对机体健康具有十分重要的作用。因此,多不饱和脂肪酸在食品、医药和饲料等多个领域均表现... 详细信息

多不饱和脂肪酸属直链脂肪酸,是机体生物膜的关键结构组分,它可以调控糖脂代谢及激素代谢,具有促进发育、提高免疫力和预防疾病等多种益生功能,对机体健康具有十分重要的作用。因此,多不饱和脂肪酸在食品、医药和饲料等多个领域均表现出重要的应用价值和广阔的开发前景,市场需求持续上升。与传统的海洋生物提取法相比,微生物合成法具有生产周期短、工艺简单、对环境友好等优势,近年来利用微生物细胞工厂生产多不饱和脂肪酸等微生物油脂逐渐成为科学界和工业界的研究热点和发展趋势。解脂耶氏酵母作为一种非常规产油酵母,因其具备高产油脂和脂肪酸的天然能力,因此成为了代谢工程改造微生物生产多不饱和脂肪酸的首选底盘细胞之一。本文首先介绍了多不饱和脂肪酸的来源及其天然合成途径;然后总结归纳了当前利用代谢工程策略改造解脂耶氏酵母生产多不饱和脂肪酸的研究现状;最后对利用解脂耶氏酵母细胞工厂生产多不饱和脂肪酸存在的主要瓶颈问题和未来发展趋势进行了探讨,期望为未来高效合成多不饱和脂肪酸微生物细胞工厂的构建提供理论支持与思路。

关键词：多不饱和脂肪酸微生物细胞工厂解脂耶氏酵母产油酵母代谢工程