检索结果-南通市图书馆

中华预防医学杂志 2024年第7期58卷 992-997页

作者：范政刘洪伯陈雨晨崔晓虎李周霏付彤彤袁静首都儿科研究所细菌学研究室北京100020 北京协和医学院研究生院北京100730

目的探讨肺炎克雷伯菌wza基因缺失对细菌荚膜形成能力及对噬菌体敏感性的影响。方法以野生型肺炎克雷伯菌株W14为背景,利用温敏型质粒介导的同源重组技术构建Δwza基因缺失菌株。在溶菌肉汤(LB)培养基固体平板观察菌落形态并在液体LB培... 详细信息

目的探讨肺炎克雷伯菌wza基因缺失对细菌荚膜形成能力及对噬菌体敏感性的影响。方法以野生型肺炎克雷伯菌株W14为背景,利用温敏型质粒介导的同源重组技术构建Δwza基因缺失菌株。在溶菌肉汤(LB)培养基固体平板观察菌落形态并在液体LB培养基中测定细菌的生长曲线。通过透射电镜,糖醛酸含量测定的方法检测wza基因缺失对肺炎克雷伯菌株荚膜形成的影响。并通过观察噬菌斑明确wza基因缺失是否影响菌株W14对噬菌体phiW14的敏感性。使用t检验比较菌株W14与Δwza 缺失菌株荚膜多糖的糖醛酸含量差异情况。结果通过PCR技术明确Δwza基因缺失菌株构建成功。LB固体平板上观察到Δwza基因缺失菌株的菌落较小,而生长曲线未观察到wza基因缺失对菌株生长速度的影响。透射电镜结果显示,wza基因缺失后菌株荚膜多糖缺失。糖醛酸含量检测表明Δwza基因缺失菌株的糖醛酸含量为(45.963±2.795)μg/ml,远低于野生型菌株W14的(138.800±5.201)μg/ml,t=27.233,Pwza基因缺失后,菌株失去了对噬菌体phiW14的敏感性。结论基因wza的缺失损害了细菌的荚膜形成能力并使得菌株失去了对噬菌体phiW14的敏感性。

关键词：肺炎克雷伯菌 wza 基因敲除荚膜噬菌体

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鸭疫里默氏菌荚膜多糖输出外膜蛋白wza基因缺失株的构建及功能研究

鸭疫里默氏菌荚膜多糖输出外膜蛋白wza基因缺失株的构建及功能研究

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作者：袁彪四川农业大学

学位级别：硕士

利用生物信息学分析软件初步确定鸭疫里默氏菌基因组中存在荚膜多糖输出基因簇及其具有多糖输出功能的wza基因,构建wza基因缺失株,初步验证wza基因在鸭疫里默氏菌在致病性、生物膜形成、抗生素抗性、抗血清杀伤作用、细胞黏附与入侵以... 详细信息

利用生物信息学分析软件初步确定鸭疫里默氏菌基因组中存在荚膜多糖输出基因簇及其具有多糖输出功能的wza基因,构建wza基因缺失株,初步验证wza基因在鸭疫里默氏菌在致病性、生物膜形成、抗生素抗性、抗血清杀伤作用、细胞黏附与入侵以及荚膜形成等生物学特征中所发挥的作用,主要结果如下：1 wza基因的生物信息学分析wza基因全长为726 bp,在其开放阅读框上游11 bp处具有典型TATA启动子结合位点。此外,在wza基因下游,具有调节荚膜多糖输出的酪蛋白激酶wzc基因、多个荚膜多糖合成相关的糖基转移酶基因以及脂质合成相关基因。该基因所编码的wza蛋白由241个氨基酸组成、分子量约26.6KD。经过氨基酸序列比对分析,发现wza蛋白与黄杆菌科细菌的多糖转运子具有较高相似性。保守功能域搜索发现,该蛋白具有Polyxport family功能域,其主要功能是负责多糖的输出。亚细胞定位预测发现其为一个外膜蛋白中的荚膜多糖输出外膜蛋白wza。wza蛋白的二级结构主要组成成分为：α螺旋(23.24%)、延伸链(30.29%)、β折叠(14.11%)以及无规则卷曲(32.37%)。最后,使用同源建模的方法,使用SWTSS-MODEL程序构律了鸭疫早默氏菌wza蛋白的三级结构。2鸭疫里默氏菌CH-1Δwza缺失株的构建本次缺失株的构建：利用自杀质粒pYA4278通过同源重组的方法将wza基因的开放阅读框中的704 bp敲掉。采用重叠PCR技术构建wza基因左臂、右臂、spc三片段的融合PCR片段Awza-spc。自杀质粒pYA4278经AdhI酶切后具有T克隆载体的T粘性末端特征,本文直接将Awza-spc融合片段克隆到pYA4278上构建了pYA4278-Δwza-spc重组自杀质粒。将含有pYA4278-Δwza-spc的大肠杆菌X7123与鸭疫里默氏菌CH-1株进行接合转移,筛选获得CH-1Δwza缺失株并经PCR鉴定正确。3鸭疫里默氏菌wza基因的部分功能初探wza基因的缺失导致鸭疫里默氏菌的生长减慢,其菌落特征基本无变化。使用透射电镜观察发现,缺失株的荚膜明显变薄。结晶紫染色分析发现鸭疫里默氏菌CH-1是一株典型的生物膜缺陷株,其OD595仅为0.049;而CH-1 Δwza的生物膜形成能力却明显的增加,其OD595为0.269。荚膜主要成分是荚膜多糖,其具有很强的亲水性效果和抗氧化能力。通过抗干燥试验以及抗氧化试验的结果可以看出,缺少荚膜保护的CH-1 Δwza在干燥环境或者低浓度的双氧水条件下的存活率远低于亲本株。此外,表面疏水性试验结果显示缺失株的疏水性显著升高。选择常用的抗生素药敏纸片检测CH-1 Δwza和其亲本株的对抗生素的敏感性的差异,与亲本株相比,CH-1 Δwza对大部分抗生素的敏感性有明显提高,表明鸭疫里默氏菌荚膜多糖的荚膜与抗生素的抗性存在联系：其荚膜与多种细菌一样,是抵抗抗生素的天然保护屏障。补体杀伤试验表明亲本株在90%血清浓度下的存活率大约为85%,而缺失株的存活率为0。说明wza基因在鸭疫里默氏菌侵染宿主以及引起败血症方面发挥着巨大作用。***是鸭疫里默氏菌的一个毒力因子细菌对宿主细胞的黏附和入侵是细菌感染宿主的先决条件,而wza基因的缺失致使鸭疫里默氏菌细胞黏附力下降,数据显示CH-1 Δwza和亲本株在黏附试验中的黏附菌落数分别为5.8×104 CFU/孔和3.6x104CFU/孔。此外,通过测定CH-1 Δwza与亲本株的LD50,发现亲本株的LD50为5.62×107CFU/mL,而缺失株CH-1△wza的LD50为2.37x1010 CFU/mL。根据LD50值可以得出wza基因的缺失导致了鸭疫里默氏菌毒力下降了421倍。因此,wza基因与鸭疫里默氏菌的致病性具有一定的联系。

关键词：鸭疫里默氏菌基因缺失 wza 荚膜毒力

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