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肝素酶Ⅰ、Ⅲ的表达和应用及*** K5 waar基因的敲除

肝素酶Ⅰ、Ⅲ的表达和应用及*** K5 waaR基因的敲除

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作者：吕沈聪浙江工业大学

学位级别：硕士

低分子量肝素是一种广泛应用于临床治疗的抗凝血药物。Heparosan是一类天然酸性多糖,在E. coli K5里以荚膜多糖的形式合成,分子量为10-20kDa,是生产肝素和硫酸乙酰肝素的前体物质。通过生物途径法从heparosan出发制备heparin的研究至关... 详细信息

低分子量肝素是一种广泛应用于临床治疗的抗凝血药物。Heparosan是一类天然酸性多糖,在E. coli K5里以荚膜多糖的形式合成,分子量为10-20kDa,是生产肝素和硫酸乙酰肝素的前体物质。通过生物途径法从heparosan出发制备heparin的研究至关重要。本课题以制备低分子量肝素为目的,表达纯化了肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅲ,并将两种酶分别应用于heparin和heparosan的解聚。为了能够定量E. coli K5发酵产物中的heparosan,建立了一种基于肝素酶Ⅲ解聚heparosan的检测样本中heparosan含量的酶学方法。同时为了提高E. coliK5的heparosan产量,应用Red同源重组技术敲除了合成E. coli K5脂多糖外核的关键基因waar。用IPTG诱导携带HepA基因的工程菌成功表达了肝素酶Ⅰ,分子量为44.83kDa。通过低温培养以及分子伴侣的协助,获得部分可溶性蛋白。将可溶性蛋白经Ni-NTA亲和层析,纯化后的酶比活为10427.50U/mg,纯化了6.47倍。将肝素酶Ⅰ应用于heparin的解聚,发现解聚效果良好。同样诱导携带HepC基因的工程菌成功表达了肝素酶Ⅲ,分子量为73.07kDa,并对酶的生产条件进行了优化。将得到的粗酶同样过柱分离纯化,纯化后酶比活为5372U/mg,纯化了1.61倍。将肝素酶Ⅲ应用于heparosan的解聚,解聚效果良好。利用肝素酶Ⅲ特异性解聚heparosan的功能,建立了一种检测样本heparosan含量的酶学方法。该法反应温和,而且操作简捷,只需通过检测酶反应产物的吸光度,就可以从标准曲线公式中推算出待测液heparosan的浓度。以*** K5基因组为模板,利用PCR技术成功克隆了waar基因。通过NCBI同源比对,发现其与E. coli strain F632waar基因相似度为99%,有两个碱基不同。将pKD46导入E. coliK5,使宿主能够表达λRed重组酶。再设计含有两端各56bp同源臂的敲除引物,以pKD4为模板,PCR扩增得到含有卡纳霉素抗性基因的打靶DNA。将打靶DNA电转化入宿主细胞,LB培养基复苏,发现复苏过夜比仅复苏2h能够得到更多具备卡那霉素抗性的转化子。转化子经PCR测序验证,重组框架全长1607bp,两端同源臂完整存在,而剩余的waar基因序列已经被筛选基因所替换。透射电镜比较野生株和突变株的荚膜形态,发现野生株表面存在一层毛绒状的物质,应为荚膜多糖层,而突变株表面较为光滑,未见荚膜。

关键词： E.coli K5 heparosan 肝素酶解聚基因敲除 waar

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*** K5及其Δ waar菌株荚膜多糖发酵制备及分子量分析

*** K5及其Δ waaR菌株荚膜多糖发酵制备及分子量分析

引用

作者：刘晓波浙江工业大学

学位级别：硕士

肝素是一种高度硫酸化的氨基聚糖,呈酸性,临床上被广泛用作抗凝血剂。硫酸乙酰肝素的硫酸化程度较肝素低,也有抗凝血活性,但弱于肝素的作用。Escherichia coli K5的荚膜heparosan的多糖链由葡萄糖酸及乙酰葡萄糖胺的重复二糖单位组成,... 详细信息

肝素是一种高度硫酸化的氨基聚糖,呈酸性,临床上被广泛用作抗凝血剂。硫酸乙酰肝素的硫酸化程度较肝素低,也有抗凝血活性,但弱于肝素的作用。Escherichia coli K5的荚膜heparosan的多糖链由葡萄糖酸及乙酰葡萄糖胺的重复二糖单位组成,其糖链骨架结构与肝素及硫酸乙酰肝素的糖链相似,heparosan可以经酶化学修饰制备肝素或硫酸乙酰肝素。因而,Escherichia coli K5可用于大量制备heparosan,以满足人工非动物源肝素或硫酸乙酰肝素生产所需。为了实现大量发酵制备纯度较高的*** K5荚膜多糖,首先考察了发酵培养基组成对*** K5产荚膜多糖的影响,发现培养基中添加葡萄糖对*** K5产荚膜多糖有利,有机氮源对*** K5发酵产荚膜多糖也有一定的影响。在确定较佳发酵培养基组成基础上,考察了几种流加补料策略对*** K5在5L发酵罐中发酵的作用效果,发现溶解氧水平是影响*** K5在5 L发酵罐中生长和产heparosan的重要因素,用于pH控制的NH·HO也会对菌体的生长产生影响。本文考察了分离纯化工艺及条件对获得多糖样品纯度的影响,比较确定了较经济,适用于*** K5荚膜多糖初级分离的硫酸铵沉淀法。同时对waar基因(编码α-1,2-糖基转移酶,该基因的缺失会影响荚膜多糖的稳定性)敲除突变株*** K5Δwaar发酵制备heparosan样品及其分子量分布情况进行分析。凝胶渗透色谱分析及多糖凝胶电泳结果均显示突变株*** K5?waar及野生菌株*** K5的荚膜多糖分子量的差异,突变株的heparosan平均分子量较低,提示了突变株发酵制备的heparosan可用于制备低分子量肝素。

关键词： E.coli K5 荚膜多糖 waar 肝素前体大肠杆菌发酵

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