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vp3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌细胞凋亡的实验研究

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VP3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌细胞凋亡的实验研究

作者：袁顺辉昆明医学院

学位级别：硕士

目的:探讨鸡贫血病毒vp3基因在人膀胱癌EJ细胞株中的表达,观察vp3基因、吉西他滨各浓度及vp3基因联合吉西他滨各浓度诱导人膀胱癌EJ细胞株凋亡的效应。方法:采用Lipofectamine2000介导的基因转染法,将真核表达载体PcDNA3-vp3转染人膀胱... 详细信息

目的:探讨鸡贫血病毒vp3基因在人膀胱癌EJ细胞株中的表达,观察vp3基因、吉西他滨各浓度及vp3基因联合吉西他滨各浓度诱导人膀胱癌EJ细胞株凋亡的效应。方法:采用Lipofectamine2000介导的基因转染法,将真核表达载体PcDNA3-vp3转染人膀胱癌EJ细胞株,利用RT-PCR技术检测vp3基因在EJ细胞中的表达状况。将吉西他滨分为三个浓度梯度,分别为10mol/L、10mol/L、10mol/L,然后将EJ细胞分为三组即:单独转染vp3基因组、吉西他滨各浓度组、vp3基因联合吉西他滨各浓度组。进而对这三组细胞分别利用MTT法检测EJ细胞的增殖活性、运用透射电镜观察凋亡细胞的形态学改变、通过流式细胞仪使用TUNAL法检测细胞凋亡的凋亡率。结果:RT-PCR结果表明,转染PcDNA3-vp3后vp3基因在EJ细胞中得到了表达;光镜和透射电镜下均能观察到凋亡细胞的典型形态学特征。MTT法检测结果显示转染重组质粒PcDNA3-vp3、吉西他滨各浓度、vp3基因联合吉西他滨各浓度的EJ细胞株的增殖活性明显下降(P＜0.01)。TUNAL法检测转染PcDNA3-vp3、10mol/L浓度的吉西他滨、vp3基因联合10mol/L浓度的吉西他滨后24h、48h、72h的EJ细胞株凋亡率分别为22.8±1.83%、48.8±1.22%、62.20±3.40%,18.3±2.11%、34.8±1.84%、50.5±1.96%,35.2%±1.50%、68.8±1.03%、85.6±3.20%,转染PcDNA3-vp3组高于转染PcDNA3及细胞、脂质体对照组(P＜0.01),联合组高于转染PcDNA3-vp3组(P＜0.01)。结论:鸡贫血病毒vp3基因的表达能够高效地诱导人膀胱癌EJ细胞株细胞凋亡,联合10mol/L浓度的吉西他滨能增加vp3基因诱导人膀胱癌EJ细胞株凋亡,为今后进一步制备和纯化Apoptin融合蛋白及其联合药物抗膀胱癌效应的研究研究奠定了实验基础。

关键词：鸡贫血病毒细胞凋亡 vp3基因吉西他滨膀胱肿瘤

雏番鸭细小病毒vp3基因的原核表达及增殖病毒的检测

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生物工程学报 2015年第1期31卷 65-74页

作者：黄瑜朱于敏董世娟于瑞嵩张源淑李震南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室江苏南京210095 上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海市农业遗传育种重点实验室上海201106

近年来,番鸭细小病毒出现新的流行趋势,估计与病毒基因变异有关,因此针对新流行毒株研发新的检测方法很有必要。本研究根据番鸭细小病毒(MDPV)2012年分离株SAAS-SHNH的全基因序列,设计了一对特异性引物,利用PCR技术扩增全长vp3基因,经... 详细信息

近年来,番鸭细小病毒出现新的流行趋势,估计与病毒基因变异有关,因此针对新流行毒株研发新的检测方法很有必要。本研究根据番鸭细小病毒(MDPV)2012年分离株SAAS-SHNH的全基因序列,设计了一对特异性引物,利用PCR技术扩增全长vp3基因,经鉴定正确后,进行同源性比对分析,同时将其克隆到PET28a载体,构建成PET28a-vp3原核表达载体,经转化及IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,表达出与预期大小相符的63.1 k Da的蛋白,该蛋白可与临床采集的免疫过MDPV的番鸭血清结合,说明该蛋白可用于MDPV的血清学检测。将纯化后蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔源MDPV-vp3蛋白的多克隆抗体,制备的兔源血清能够与MDPV疫苗弱毒株及J3D6株vp3蛋白发生特异结合;MDPV感染原代鸭胚成纤维细胞(DEF)后,利用兔源血清作为一抗进行免疫荧光分析(IFA)分析,在DEF细胞核和细胞质内均能检测到vp3蛋白,表明利用vp3蛋白制备的抗血清可以用于MDPV免疫荧光分析细胞增殖病毒的检测。这为今后MDPV的快速检测提供了技术基础。

关键词： vp3基因原核表达纯化免疫荧光分析

vp3基因联合多西紫杉醇诱导人前列腺癌细胞株凋亡的实验研究

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VP3基因联合多西紫杉醇诱导人前列腺癌细胞株凋亡的实验研究

作者：李天庆昆明医学院

学位级别：硕士

目的探讨鸡贫血病毒中vp3基因在人非激素依赖性前列腺癌细胞株PC-3中的表达,观察vp3基因、多西紫杉醇各浓度及vp3基因联合多西紫杉醇各浓度对PC-3细胞株的凋亡作用。方法构建重组真核表达载体PcDNA3-vp3,采用脂质体Lipofectamine介导... 详细信息

目的探讨鸡贫血病毒中vp3基因在人非激素依赖性前列腺癌细胞株PC-3中的表达,观察vp3基因、多西紫杉醇各浓度及vp3基因联合多西紫杉醇各浓度对PC-3细胞株的凋亡作用。方法构建重组真核表达载体PcDNA3-vp3,采用脂质体Lipofectamine介导的基因转染法转染人前列腺癌细胞株PC-3。利用RT-PCR技术检测vp3基因在PC-3细胞株中的表达状况。将多西紫杉醇浓度分为三组,分别为10mol/L、10mol/L、10mol/L。应用光镜、HE染色、透射电镜形态学、MTT法、流式细胞仪TUNEL法观察单独转染重组质粒PcDNA3-vp3、多西紫杉醇各浓度及重组质粒PcDNA3-vp3联合多西紫杉醇各浓度对前列腺癌细胞株PC-3的影响。结果成功酶切鉴定及测序分析表明vp3基因与预期相符。RT-PCR结果表明,转染PC-3细胞后vp3基因在细胞中得到了表达。光镜、HE染色和透射电镜下观察到PC-3细胞的典型凋亡形态学特征。MTT法检测结果显示转染质粒PcDNA3-vp3,单独应用10mol/L以上浓度的多西紫杉醇及转染质粒PcDNA3-vp3联合应用10mol/L以上浓度的多西紫杉醇均可使PC-3细胞株的增殖活性明显下降(P＜0.01)。流式细胞仪TUNAL法检测单独转染质粒PcDNA3-vp3、质粒PcDNA3-vp3联合10mol/L浓度组及质粒PcDNA3-vp3联合10mol/L浓度组后24h、48h、72h各个时间点上的PC-3细胞株凋亡率分别为(20.31±1.96)%、(41.50±1.03)%、(50.03±3.00)%,(P＜0.01);(31.10±0.59)%、(53.10±0.77)%、(68.90±2.66)%(P＜0.01);(40.01±0.53)%、(62.23±0.74)%、(75.20±0.53)%(P＜0.01)。转染PcDNA3-vp3组高于转染PcDNA3及细胞对照组、脂质体对照组(P＜0.01),联合用药组高于单独转染PcDNA3-vp3组(P＜0.01)。结论鸡贫血病毒vp3基因的表达能够早期、高效地诱导人前列腺癌PC-3细胞株凋亡。联合10mol/L以上浓度的多西紫杉醇能明显增加vp3基因诱导人前列腺癌PC-3细胞株凋亡。预计联合用药可能会减少临床应用时多西紫杉醇的浓度,减少并发症。并为激素非依赖性前列腺癌的基因治疗联合化疗提供了新的思路。

关键词： vp3基因多西紫杉醇前列腺癌 PC-3细胞细胞凋亡

鹅细小病毒野毒株vp3基因的原核表达及抗原性检测

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中国兽医科学 2009年第6期39卷 492-497页

作者：鞠环宇卫娜尚绪增荆志强郭鹭马波王君伟东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

根据发表的鹅细小病毒(GPV)基因序列设计合成了2对检测GPV的特异性引物,用其对疑似小鹅瘟的病料进行PCR检测,经序列比对后确定为GPV感染;利用引物Gs/Ga扩增获得的GPV野毒株vp3基因,测序后将vp3基因连接到原核表达载体pET-30a上,获得重... 详细信息

根据发表的鹅细小病毒(GPV)基因序列设计合成了2对检测GPV的特异性引物,用其对疑似小鹅瘟的病料进行PCR检测,经序列比对后确定为GPV感染;利用引物Gs/Ga扩增获得的GPV野毒株vp3基因,测序后将vp3基因连接到原核表达载体pET-30a上,获得重组质粒pET-30a-vp3,将其转化感受态菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析。结果显示,重组菌可表达出分子质量约为66 000 u的重组融合蛋白,表达的蛋白以包涵体形式存在于菌体中。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,获得了纯度较高的目的蛋白。Western-blot分析结果显示,纯化的蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,证实表达的蛋白具有较好的抗原性。

关键词：鹅细小病毒 vp3基因克隆原核表达纯化抗原性

新型环形病毒AGV2的vp3基因的克隆表达及多抗制备

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中国兽医科学 2016年第10期46卷 1264-1269页

作者：施洋洋田晓彦马靖雯韦芊含邵红霞秦爱建叶建强禽类预防医学教育部重点实验室江苏省动物预防医学重点实验室扬州大学兽医学院江苏扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

新型环形病毒AGV2最早于2011年报道。为建立AGV2血清学诊断方法,并探究其vp 3基因功能,本研究对AGV2的vp3基因进行了克隆、表达及多抗制备。通过将AGV2 vp3基因克隆进pGEX-6p-1原核表达载体,获得了可溶性GST-vp3融合表达产物,并利用纯化... 详细信息

新型环形病毒AGV2最早于2011年报道。为建立AGV2血清学诊断方法,并探究其vp 3基因功能,本研究对AGV2的vp3基因进行了克隆、表达及多抗制备。通过将AGV2 vp3基因克隆进pGEX-6p-1原核表达载体,获得了可溶性GST-vp3融合表达产物,并利用纯化的GST-vp3蛋白制备了小鼠抗GST-vp3多克隆抗体。同时构建获得了pcDNA3.1-vp3以及EGFP-vp3两个AGV2 vp 3基因真核表达载体。间接免疫荧光试验以及EGFP观察发现,AGV2的vp3蛋白及其EGFP融合蛋白EGFP-vp3在HCT116肿瘤细胞中的表达集中于细胞核,且呈散在点状分布,类似凋亡小体。这些AGV2 vp3表达载体的构建,表达产物、小鼠多克隆抗体的获得及其在肿瘤细胞中的表达分布,为进一步研制AGV2血清学诊断方法提供了材料,为深入探究AGV2 vp3的生物学功能打下了基础。

关键词： AGV2 vp3基因表达多克隆抗体

新型鸭细小病毒vp3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2016年第6期46卷 717-722页

作者：李琦李传峰唐井玉刘柱宫晓华陈宗艳王桂军吴润刘光清甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

应用PCR方法扩增了新型鸭细小病毒(novel duck parvovirus,NDPV)的vp3基因,然后将其克隆到原核表达载体p GEX-4T-1中,获得重组质粒p GEX-vp3。将p GEX-vp3转化BL21感受态细胞后,用1.0mmol/L IPTG于37℃进行诱导。最后,分别用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定。结果,NDPV vp3蛋白在大肠杆菌细胞中成功获得表达,表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量为84 ku。将纯化的重组vp3蛋白免疫实验家兔,制备多克隆抗体。Western-blot检测结果表明,该抗体能同时与重组的NDPV vp3蛋白及自然感染的NDPV发生反应,说明制备的抗体具有良好的抗原反应性。这些结果为进一步建立NDPV检测方法和研发新型疫苗研究奠定了物质基础。

关键词：新型鸭细小病毒 vp3基因原核表达多克隆抗体

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A组人轮状病毒vp3基因的原核表达及鉴定

中国生物制品学杂志 2012年第2期25卷 152-156页

作者：张顺潘小霞袁静文喻玲陈元鼎中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的克隆并原核表达A组人轮状病毒(Rotavirus,RV)TB-Chen株结构蛋白vp3基因,并进行分子系统进化和基因分型。方法采用PCR法扩增A组人轮状病毒TB-Chen株vp3编码基因,克隆至pETL载体上,构建重组原核表达质粒pET-vp3,转化大肠杆菌BL21(DE3)... 详细信息

目的克隆并原核表达A组人轮状病毒(Rotavirus,RV)TB-Chen株结构蛋白vp3基因,并进行分子系统进化和基因分型。方法采用PCR法扩增A组人轮状病毒TB-Chen株vp3编码基因,克隆至pETL载体上,构建重组原核表达质粒pET-vp3,转化大肠杆菌BL21(DE3),并进行表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,对vp3基因进行分子系统进化及基因型分析。结果重组表达质粒pET-vp3经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为98 000,以包涵体形式存在;重组vp3蛋白可被抗SA11株全病毒豚鼠免疫血清识别;迄今发现的A组RV vp3可分为7个基因型,TB-Chen株和SA11株vp3基因分别属于M2型和M5型。结论成功原核表达了A组人RV TB-Chen株vp3蛋白,为进一步研究vp3的结构功能及开发新型RV疫苗、诊断试剂和治疗药物奠定了基础。

关键词：轮状病毒属 vp3基因原核细胞基因表达基因分型

鹅细小病毒vp3基因重组禽痘病毒转移载体的构建

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中国兽医科技 2002年第9期32卷 5-8页

作者：田丽红贾永清王君伟李一经赵丽荣 Ulrich Neu mann 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 汉诺威兽医学院德国汉诺威30559

从含有鹅细小病毒 (GPV)H1株主要结构蛋白vp3基因的重组质粒pPROEXHTb vp3中切取GPVH 1株vp3基因片段 ,将其亚克隆于 pSY5 3 8的EcoRⅠ位点 ,并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaⅠ位点 ,再用NotⅠ切下... 详细信息

从含有鹅细小病毒 (GPV)H1株主要结构蛋白vp3基因的重组质粒pPROEXHTb vp3中切取GPVH 1株vp3基因片段 ,将其亚克隆于 pSY5 3 8的EcoRⅠ位点 ,并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaⅠ位点 ,再用NotⅠ切下同时含有vp3基因和LacZ报告基因的片段 ,亚克隆于pSY681的NotⅠ位点 ,构建了含有vp3基因的重组禽痘病毒转移载体。

关键词：鹅细小病毒 vp3基因重组禽痘病毒转移载体小鹅瘟

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒vp3基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

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江苏农业学报 2017年第3期33卷 649-653页

作者：王安平朱善元王永娟吴双左伟勇洪伟鸣江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室江苏泰州225300

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus type-I,DHAV-I)SH株的主要结构蛋白vp3,首先根据DHAV-I SH株vp3基因序列设计1对引物,RT-PCR方法扩增出vp3基因,克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组杆状病毒转移... 详细信息

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus type-I,DHAV-I)SH株的主要结构蛋白vp3,首先根据DHAV-I SH株vp3基因序列设计1对引物,RT-PCR方法扩增出vp3基因,克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-vp3,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-vp3,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒r Bac-vp3。间接免疫荧光结果显示重组蛋白获得了正确表达,能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。Western blot结果显示表达的重组蛋白分子量约为27 000。表明,DHAV-I SH株的主要结构蛋白vp3在昆虫细胞中获得了成功表达,为vp3结构蛋白的功能研究及相关亚单位疫苗的研制奠定了基础。

关键词： Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒 vp3基因昆虫细胞表达鉴定