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表面展示传染性法氏囊病病毒vp2蛋白细菌样颗粒的构建与鉴定

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黑龙江畜牧兽医 2024年第2期 65-71,78页

作者：洪新雅段姝宇兰奇官王瑞楠朱凡王春凤王建忠吉林农业大学动物医学院吉林省微生态制剂工程研究中心/动物生产及产品质量安全教育部重点实验室长春130118

为构建表面展示传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)vp2蛋白的细菌样颗粒(bacterium-like particies, BLPs),试验分别克隆vp2基因和乳酸乳球菌肽聚糖锚钩蛋白(protein anchor, PA)基因片段,通过融合PCR技术构建vp2-PA融合基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统构建重组杆状病毒rBV-vp2-PA,将表达产物与裸露BLPs共孵育,在PA的介导下,构建表面展示IBDV vp2蛋白的细菌样颗粒(BLPs-vp2);依次采用透射电镜观察、SDS-PAGE、Western-blot、间接免疫荧光对BLPs-vp2进行鉴定。结果表明:vp2蛋白获得成功表达并展示于BLPs表面,可与IBDV阳性血清发生特异性结合,1 U(2.5×10~9颗粒)BLPs最大可负载约107μg vp2-PA融合蛋白。说明构建的IBDV vp2蛋白BLPs可用于传染性法氏囊病(IBD)新型亚单位疫苗的研发。

关键词：传染性法氏囊病 vp2蛋白细菌样颗粒细菌表面展示系统亚单位疫苗

非洲马瘟病毒vp2蛋白的截短表达及免疫原性分析

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中国兽医科学 2024年第8期54卷 1087-1095页

作者：王轩莹范亚亚户鑫兵徐婧张鸿歌田占成苟惠天郑玉姝关贵全罗建勋殷宏独军政中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 河南科技学院动物科技学院河南新乡453003 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

为评价非洲马瘟病毒(AHSV)vp2截短蛋白的免疫原性,以人工合成的含有AHSV S2的全长基因为模板,分别构建重组表达质粒p RSF-S2-502(编码1~502 aa)和p RSF-S2-1056(编码503~1056 aa),分别将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。... 详细信息

为评价非洲马瘟病毒(AHSV)vp2截短蛋白的免疫原性,以人工合成的含有AHSV S2的全长基因为模板,分别构建重组表达质粒p RSF-S2-502(编码1~502 aa)和p RSF-S2-1056(编码503~1056 aa),分别将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。将纯化后的重组蛋白免疫小鼠后,采用间接ELISA测定小鼠血清中特异性抗体水平,用流式细胞术检测小鼠脾T细胞亚群、CD4^(+)和CD8^(+)T细胞表达IFN-γ的水平。结果显示,与PBS对照组相比,各免疫组小鼠血清中特异性抗体水平均显著升高,脾内CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞水平均显著升高;免疫组小鼠脾CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞表达IFN-γ的水平均升高。结果表明,重组AHSV vp2截短蛋白对小鼠具有较好的免疫原性,为进一步研究vp2蛋白生物学功能及非洲马瘟病毒亚单位疫苗奠定了理论基础。

关键词：非洲马瘟病毒 vp2蛋白截短表达免疫原性

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定及vp2蛋白的原核表达

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黑龙江畜牧兽医 2024年第12期 59-63,68,125页

作者：魏玲熊荣园王思怡梁洪龙冬梅杨国淋南充职业技术学院四川南充637131 川北医学院四川南充637100

为了获得鸭源新型鹅细小病毒(NGPV)流行毒株并表达vp2蛋白,试验采集患短喙侏儒综合征的死亡鸭肝脏组织病料样本,首先通过鸭胚传代培养分离病毒,然后对分离毒株进行血凝试验、PCR检测、鸭胚半数致死量(ELD_(50))测定及致病性试验,最后对... 详细信息

为了获得鸭源新型鹅细小病毒(NGPV)流行毒株并表达vp2蛋白,试验采集患短喙侏儒综合征的死亡鸭肝脏组织病料样本,首先通过鸭胚传代培养分离病毒,然后对分离毒株进行血凝试验、PCR检测、鸭胚半数致死量(ELD_(50))测定及致病性试验,最后对vp2蛋白进行诱导表达、可溶性分析、纯化及Western-blot鉴定。结果表明:从临床病料样本中分离到1株病毒,将该毒株接种鸭胚,鸭胚的死亡时间均集中在接种后的第48~72小时之间,死亡鸭胚出现绒毛尿囊膜增厚、胚体有大量出血点、鸭喙短小等短喙侏儒综合征的典型病变特征,将分离毒株命名为SCNC01株。SCNC01株不能凝集1%鸡红细胞,在其基因组DNA中可扩增出NGPV NS1基因序列,该序列与GenBank中的NGPV NS1基因序列相似性在90.6%~98.3%之间,SCNC01株与MK000549、MN415966、JF333590、KC996729、KT598506、MW929338等NGPV毒株处于同一分支,确定该毒株为NGPV。SCNC01株的ELD_(50)为1×10^(-4.5)/0.2 mL,可引起雏鸭出现运动障碍、食欲下降、精神萎靡、喙萎缩、舌头外翻、排白色稀便等临床症状甚至死亡。经IPTG诱导NGPV vp2蛋白获得了表达,且表达形式为包涵体,经His-Tag蛋白纯化柱纯化后,出现与目的蛋白大小一致的单一条带,该蛋白能与NGPV阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。说明试验成功分离到1株鸭源NGPV,并获得了具有良好反应原性的vp2蛋白。

关键词：鸭新型鹅细小病毒(NGPV) 病毒分离病毒鉴定短喙侏儒综合征 vp2蛋白原核表达

A型塞内卡病毒vp2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

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中国畜牧兽医 2024年第2期51卷 678-688页

作者：任建乐林铱婷姬康谭姗姗陈新新晋怡王颖牛胜梁立滨李俊平赵宇军田文霞山西农业大学动物医学学院太谷030801 北京索莱宝科技有限公司北京101102

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)vp2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将vp2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-vp2,... 详细信息

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)vp2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将vp2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-vp2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以vp2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组vp2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组vp2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定vp2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的vp2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和vp2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

关键词： A型塞内卡病毒(SVA) vp2蛋白原核表达多克隆抗体间接ELISA

猪细小病毒7型vp2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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黑龙江畜牧兽医 2024年第14期 56-60页

作者：吕紫欣张鑫杰薛少华黄喜荣刘建奎戴爱玲龙岩学院生命科学学院福建龙岩364012 福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福州350002 福建省生猪疫病防控工程技术研究中心福建龙岩364012 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室福建龙岩364012

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)vp2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5... 详细信息

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)vp2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,并使用IPTG对重组菌进行诱导,对表达的重组蛋白进行可溶性分析与纯化并通过Western-blot检测重组蛋白的反应原性,用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并分别通过间接ELISA方法、Western-blot检测多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组菌在56 ku处出现明显条带,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;纯化后的重组蛋白为单一条带,质量浓度为0.46 mg/mL,能与His标签抗体特异性结合;制备的多克隆抗体的效价为1∶51200,能与重组蛋白特异性结合。说明PPV7 vp2蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体效价较高。

关键词：猪细小病毒7型 vp2蛋白 Cap基因原核表达多克隆抗体

犬细小病毒HN-078株vp2蛋白单克隆抗体制备及B细胞线性表位鉴定

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犬细小病毒HN-078株VP2蛋白单克隆抗体制备及B细胞线性表位鉴定

作者：郭江涛河南农业大学

学位级别：硕士

犬细小病毒病（Canine parvovirus disease,CPD）是由犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）引起的一种高度传染性疾病。CPV包含两个开放阅读框架（Open reading frame,ORF）。其中,ORF1负责编码非结构蛋白NS1和NS2,而ORF2则编码结构蛋白... 详细信息

犬细小病毒病（Canine parvovirus disease,CPD）是由犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）引起的一种高度传染性疾病。CPV包含两个开放阅读框架（Open reading frame,ORF）。其中,ORF1负责编码非结构蛋白NS1和NS2,而ORF2则编码结构蛋白vp1和vp2。vp2是病毒衣壳中最主要的成分,占比约90%,并且是主要的抗原决定因素,具有可被B细胞识别的抗原表位。在CPV感染过程中,vp2能有效地诱导犬只产生中和抗体,因此广泛被认为是一种有效的保护性抗原。这一发现为CPV的诊断和特异性治疗提供了重要的研究目标。CPV的诊断和治疗离不开具有特异性、高效性并能快速大量制备的抗体,而单克隆抗体正好符合这些条件,已被广泛应用于免疫学和病毒学检测领域。本研究首先扩增和纯化CPV,并以此灭活病毒作为抗原来免疫BALB/c小鼠。通过间接ELISA筛选出血清中CPV抗体效价最高的小鼠,随后分离其脾细胞,利用细胞融合技术将脾细胞与SP2/0细胞融合,通过全病毒包被抗原和间接ELISA、IPMA鉴定能够分泌CPV抗体的阳性杂交瘤细胞株。接下来通过原核表达系统表达的vp2蛋白包被抗原对杂交瘤单克隆细胞株进行鉴定,筛选出了3株能稳定分泌vp2抗体的细胞株,分别命名为43-17-3-5、48-18-3和63-30-38。对这3株单克隆细胞株进行了染色体数目分析,结果显示其染色体数目均介于96-105条,大约等于浆细胞和SP2/0细胞染色体数目之和。接下来对43-17-3-5、48-18-3和63-30-38三株杂交瘤细胞株分泌的vp2单克隆抗体亚型进行鉴定,其亚类分别为Ig M、Ig M和Ig G2b,轻链均为Kappa链。通过IFA、Western blot和交叉反应性试验验证了三个vp2单克隆抗体特异性,它们在Western blot中的稀释比分别为1:500、1:1 000和1:200,且与犬腺病毒无交叉反应性。病毒中和试验发现43-17-3-5单克隆抗体具有部分CPV中和活性,而48-18-3和63-30-38两个单克隆抗体无CPV中和活性。为了鉴定三个vp2单克隆抗体识别的vp2 B细胞线性表位,依据软件预测的vp2蛋白二级和三级结构,构建了vp2蛋白的截短重组质粒并利用Western blot验证。结果显示这三个单克隆抗体识别的vp2 B细胞线性表位分别为:43-17-3-5:558QFNYvpSNIGGMKIVYEKSQLAPRKLY584;48-18-3:452GPLTALNNvpPVYPNGQIWDKEFDTDLKPRLHV484;63-30-38:41STGTFNNQTEFKFLENGWVEITANSS73)。综上所述,本研究成功制备了3株具有良好反应原性和特异性的vp2单克隆抗体,为vp2蛋白的结构和功能研究和免疫学诊断奠定了基础。

关键词： CPV vp2蛋白抗原表位单克隆抗体 B细胞线性表位

抗鸡传染性贫血病毒vp2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究

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中国兽药杂志 2024年第8期58卷 1-8页

作者：侯力丹薛麒王嘉孔冬妮吴宏举翟天舒邓永毛娅卿吴华伟孙瑶刘丹中国兽医药品监察所(农业农村部兽药评审中心) 北京100081 中牧实业股份有限公司北京100070

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的vp2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗vp2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交... 详细信息

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的vp2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗vp2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-vp2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗vp2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID 50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV vp2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。

关键词：鸡传染性贫血病毒 vp2蛋白单克隆抗体间接免疫荧光

表达猪细小病毒vp2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应

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病毒学报 2016年第2期32卷 195-202页

作者：付朋飞潘鑫龙乔涵杨兴武朱前磊郭晓庆张宇陈红英河南农业大学牧医工程学院郑州450002 大北农动物医学研究中心北京100195 河南省动物疫病预防控制中心郑州450008 郑州市猪重大疫病防控重点实验室郑州450002

为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV vp2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGvp2。利用脂质体转染法将重组质粒pG... 详细信息

为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV vp2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGvp2。利用脂质体转染法将重组质粒pGvp2和PRV HB98弱毒株DNA共转染至猪睾丸(ST)细胞,使其在ST细胞内发生同源重组,经5次绿色荧光空斑纯化重组病毒rPRV-vp2。分别用重组病毒rPRV-vp2、亲本PRV HB98弱毒株、商品化PPV灭活苗和DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性昆明小鼠,2周后进行二免。一免后第7周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒。结果获得表达vp2基因的重组病毒rPRV-vp2,经ELISA试验、血清中和试验(SN)、血凝抑制试验(HI)和流式细胞检测发现,重组病毒rPRV-vp2株可有效刺激小鼠机体产生抗PPV和PRV抗体,同时具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力,且对PRV强毒攻击具有保护作用。结果表明,重组病毒rPRV-vp2可作为同时预防PPV和PRV感染的重组疫苗候选株。

关键词：猪细小病毒猪伪狂犬病毒 vp2蛋白重组病毒免疫效力

猪瘟病毒T细胞表位E290多肽与猪细小病毒vp2蛋白在干酪乳杆菌中的共表达及免疫小鼠特异性抗体的测定

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微生物学报 2007年第4期47卷 667-672页

作者：徐义刚崔丽春葛俊伟赵丽丽李一经马广鹏唐丽杰东北农业大学动物医学院哈尔滨150030 东北林业大学哈尔滨150040

将分别编码猪瘟病毒T细胞表位E290多肽和猪细小病毒主要保护性抗原vp2蛋白的重组基因插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG中,构建了重组表达载体pPG-vp2-E290,将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393,获得了猪瘟病毒T细胞表位E290多... 详细信息

将分别编码猪瘟病毒T细胞表位E290多肽和猪细小病毒主要保护性抗原vp2蛋白的重组基因插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG中,构建了重组表达载体pPG-vp2-E290,将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393,获得了猪瘟病毒T细胞表位E290多肽与猪细小病毒vp2蛋白的乳酸菌共表达系统,经2%乳糖在MRS培养基中的诱导表达,对诱导表达的菌体及培养上清液进行SDS-PAGE检测表明,有约70kDa蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot分析结果表明所表达的蛋白具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性。以诱导表达上清液作为抗原进行的间接ELISA实验也表明,重组的目的蛋白获得了分泌表达。将该重组干酪乳杆菌经口服接种途径免疫BALB/c小鼠,收集粪便样品检测小鼠产生抗PPV的特异性sIgA抗体,采集血液样本检测血清中抗PPV及抗E290的特异性IgG。结果表明分泌型的重组菌pPG-vp2-E290/*** 393免疫小鼠能够产生明显的抗体水平,为重组猪瘟与猪细小病毒乳酸菌口服活菌疫苗的研制奠定了重要的物质基础。

关键词：猪瘟病毒 T细胞表位猪细小病毒 vp2蛋白干酪乳杆菌特异性抗体