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表达PCV-2 Cap和PPV-1 vp2蛋白的重组PRV的构建及鉴定

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黑龙江畜牧兽医 2019年第5期 16-22,175页

作者：谢永兴夏德利黄立平危艳武吴洪丽朱红振冯力刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

为了构建表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白和猪细小病毒1型(PPV-1)vp2蛋白的重组伪狂犬病病毒(PRV)及鉴定其免疫原性,试验采用经典同源重组技术构建重组病毒,利用密码子优化的vp2基因(vp2_(opti))和含PRV gG蛋白信号肽序列的vp2_(opti)... 详细信息

为了构建表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白和猪细小病毒1型(PPV-1)vp2蛋白的重组伪狂犬病病毒(PRV)及鉴定其免疫原性,试验采用经典同源重组技术构建重组病毒,利用密码子优化的vp2基因(vp2_(opti))和含PRV gG蛋白信号肽序列的vp2_(opti)基因分别构建重组质粒pMD18T-LR(TK)-vp2_(opti)和pMD18T-LR(TK)-vp2_(opti)(SP)。用已构建的重组病毒rPRV-TK^-/gE^-/gG^-/3Cap^+为骨架,以EGFP为标签经同源重组获得重组病毒。采用IPMA法鉴定Cap蛋白和vp2蛋白抗原在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达,采用IFA法鉴定vp2蛋白在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达与定位。用这2株重组病毒免疫小鼠,通过检测血清中PRV、PCV-2和PPV-1抗体水平对构建的重组病毒在小鼠体内的免疫原性进行评价。结果表明:经同源重组获得重组病毒rPRV-TK^-/vp2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+和rPRV-TK^-/vp2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+;在重组病毒感染的PK-15细胞中均能检测到阳性Cap蛋白和vp2蛋白抗原;重组病毒rPRV-TK^-/vp2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的vp2蛋白定位于细胞浆和细胞核,而重组病毒rPRV-TK^-/vp2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的vp2蛋白定位于细胞浆;用这2株重组病毒免疫小鼠能够检测到PRV中和抗体;用灭活的重组病毒免疫小鼠后可产生低水平的Cap和vp2抗体,而重组病毒活毒免疫的小鼠未检测到相应抗体。说明这2株重组病毒在体外能够表达Cap蛋白和vp2蛋白,PRV gG蛋白信号肽序列的加入促进了vp2蛋白从细胞核的释放。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白猪细小病毒1型 vp2蛋白重组伪狂犬病病毒重组质粒免疫原性

犬细小病毒vp2蛋白特点及病毒样颗粒疫苗制备研究进展

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中国畜牧兽医 2023年第8期50卷 3286-3293页

作者：杨媛茹焦雪宋维林刘许峰汪惠庆李月红吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 桦甸市公吉乡综合服务中心吉林132402 长春西诺生物科技有限公司长春130012

犬细小病毒病危害犬的健康,传统疫苗不能有效保护犬免受病毒的侵扰,寻求新的疫苗是当前研究和关注的热点。vp2蛋白是犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的主要保护性抗原蛋白,在决定宿主范围和入侵过程中起重要作用。此外,vp2蛋白在N-... 详细信息

犬细小病毒病危害犬的健康,传统疫苗不能有效保护犬免受病毒的侵扰,寻求新的疫苗是当前研究和关注的热点。vp2蛋白是犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的主要保护性抗原蛋白,在决定宿主范围和入侵过程中起重要作用。此外,vp2蛋白在N-端结构域和环结构域中含有几个重要的B细胞表位,可在CPV感染过程中诱导产生有效的中和抗体。因此,在开发CPV基因组亚单位疫苗中,vp2蛋白可作为候选抗原的首选。病毒样颗粒(VLPs)与天然病毒相似,但不具备天然病毒的复制功能引起机体发生感染,故近几年来利用不同的表达系统组装vp2蛋白一直是研究者们研究的重点。笔者着重对CPV vp2蛋白的特点及构象进行分析,通过特点分析得知CPV衣壳的主要成分中含有vp2,不但具有血凝活性,还与CPV的宿主范围和抗原性密切相关,因此,有活性的vp2蛋白在CPV基因工程亚单位疫苗的开发中极其重要。通过构象分析得知CPV vp2蛋白环状结构(Flexible loop)具有更大的灵活性,这可能是CPV感染宿主范围不断扩大的分子基础。同时笔者对VLPs疫苗的制备方法及优缺点进行讨论,以期为CPV疫苗的研究制备提供有利的参考和科学依据。

关键词：犬细小病毒(CPV) 病毒样颗粒(VLPs) 疫苗 vp2蛋白

表达传染性法氏囊病病毒vp2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5的构建及鉴定

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中国畜牧兽医 2022年第12期49卷 1424-1434页

作者：徐婷熊挺李淋雨刘郁夫温良海谢文婷杨泽坤陈瑞爱华南农业大学兽医学院广州510642 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心肇庆526238 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司肇庆526238 肇庆大华农生物药品有限公司肇庆526238

【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)vp2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源... 详细信息

【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)vp2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将vp2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-vp2;PmeⅠ酶线性化pAdTrack-vp2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞,利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-vp2;将pAd-vp2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞,包装表达vp2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5 (rAd5-vp2),将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞(Vero、CEF和DF1细胞)并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-vp2通过HEK293A细胞扩大培养,测得第10代病毒的滴度为7.9×10~9 IFU/mL;RT-PCR结果显示,vp2基因在重组腺病毒中能稳定翻译;Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到vp2蛋白的表达,蛋白分子质量为41 ku;将rAd5-vp2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到vp2蛋白的表达,表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5,该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。

关键词：传染性法氏囊病 vp2蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒

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鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白可溶性原核表达及免疫原性分析

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中国兽医学报 2017年第12期37卷 2281-2287页

作者：李赛赛郭玉堃舒静超曾磊郭婉莹郭豫杰河南农业大学牧医工程学院农业部动物生化与营养重点实验室河南郑州450002

为在大肠杆菌中表达出高可溶性的vp2-LS3蛋白笼纳米颗粒并检测其免疫原性,将扩增的7种融合标签(GST、NusA、MBP、PpiB、γ-crystallin、ArsC和Grifin)片段连在vp2-LS3基因的N端,构建7个带有不同标签的重组原核表达载体。再将其分别转化... 详细信息

为在大肠杆菌中表达出高可溶性的vp2-LS3蛋白笼纳米颗粒并检测其免疫原性,将扩增的7种融合标签(GST、NusA、MBP、PpiB、γ-crystallin、ArsC和Grifin)片段连在vp2-LS3基因的N端,构建7个带有不同标签的重组原核表达载体。再将其分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,筛选出显著促进vp2-LS3蛋白可溶性表达的融合标签,并进行大量诱导表达、纯化。纯化得到的vp2-LS3重组蛋白分别进行TEV酶酶切、电镜观察分析及免疫家兔,并对获得的兔抗vp2血清进行Western blot和间接ELISA分析。结果显示,与其他6个标签相比,MBP标签促进vp2-LS3蛋白的可溶性表达具有显著性,可溶性表达水平达到69.5%;TEV酶可以把His6-MBP标签蛋白与vp2-LS3蛋白分开,获得高纯度的vp2-LS3蛋白;镜检显示形成了LS3蛋白笼纳米颗粒;Western blot结果表明,表达的vp2-LS3重组蛋白可与兔抗血清发生特异性反应,而不与阴性对照血清发生反应;间接ELISA检测制备的兔抗vp2血清效价达到1∶12 800。本研究获得了高可溶性的vp2-LS3蛋白笼纳米颗粒,为传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程疫苗的研发奠定基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 vp2蛋白融合标签可溶性表达 LS3蛋白笼纳米颗粒免疫原性

猪细小病毒核衣壳vp2蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

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中国兽医杂志 2010年第5期46卷 9-11,I0001页

作者：刘秀芬李一经东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

以纯化的PPV重组vp2蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA筛选和3次以上细胞克隆,获得了5株稳定分泌抗PPV vp2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为2D5、1F11、2B4、3C8、1 H3。其染色体平均数均为87～102条,分泌抗体亚类4... 详细信息

以纯化的PPV重组vp2蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA筛选和3次以上细胞克隆,获得了5株稳定分泌抗PPV vp2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为2D5、1F11、2B4、3C8、1 H3。其染色体平均数均为87～102条,分泌抗体亚类4株为Ig M类,1株为IgG类,Western blot检测表明,5株单抗均识别猪细小病毒vp2蛋白;间接免疫荧光鉴定表明,5株单抗均与PPV全病毒发生反应;间接ELISA鉴定与其他相关病毒的交叉反应性表明,制备的5株单抗不与TEGV、PRV和PEDV反应,表明所制备的抗体与猪细小病毒具有较强的特异性反应。

关键词：猪细小病毒 vp2蛋白单克隆抗体

鹅细小病毒vp2蛋白单克隆抗体的研制及鉴定

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畜牧与兽医 2022年第9期54卷 85-89页

作者：陈柳倪征华炯钢叶伟成云涛朱寅初张存浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021

为了制备鹅细小病毒(GPV)vp2蛋白的特异性单克隆抗体,将vp2基因克隆至大肠杆菌原核表达载体pET28a(+),构建了pET28a-vp2原核表达质粒,经过诱导表达并纯化获得了vp2蛋白。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备了3株可稳定分泌与G... 详细信息

为了制备鹅细小病毒(GPV)vp2蛋白的特异性单克隆抗体,将vp2基因克隆至大肠杆菌原核表达载体pET28a(+),构建了pET28a-vp2原核表达质粒,经过诱导表达并纯化获得了vp2蛋白。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备了3株可稳定分泌与GPV vp2蛋白结合的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为:F5-B7、C4-4和B9-C5。抗体分型结果显示,3株单克隆抗体轻链均为κ链,F5-B7和C4-4重链亚类为IgG2b, B9-C5重链亚类为IgG1。以vp2蛋白为包被抗原,采用间接ELISA方法检测表明,F5-B7和C4-4两个单抗效价可达1∶240 000,B9-C5单抗为1∶20 000。间接免疫荧光和免疫印迹试验表明,这3株抗体皆能与GPV发生特异性反应。本研究为鹅细小病毒vp2蛋白表位鉴定、病毒和vp2蛋白结构功能研究、鹅细小病毒诊断试剂的开发及基因工程抗体的研究等奠定了基础。

关键词：鹅细小病毒 vp2蛋白单克隆抗体

25型蓝舌病病毒vp2蛋白的原核表达及鉴定

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畜牧与兽医 2017年第9期49卷 83-87页

作者：谢双羽武啸臧明鑫李佳璇徐义刚姜艳平崔文李一经唐丽杰东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

为获得体外表达的25型蓝舌病病毒(BTV)vp2蛋白,本研究以NCBI上发表的25型BTV L2基因序列为模版,设计3对引物,PCR扩增3段部分重叠基因。将3段基因克隆到原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒。以1.0 mmol/L的IPTG诱导含有阳性质粒的... 详细信息

为获得体外表达的25型蓝舌病病毒(BTV)vp2蛋白,本研究以NCBI上发表的25型BTV L2基因序列为模版,设计3对引物,PCR扩增3段部分重叠基因。将3段基因克隆到原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒。以1.0 mmol/L的IPTG诱导含有阳性质粒的重组菌p ET-28a(+)-vp2-A/BL21、p ET-28a(+)-vp2-B/BL21、p ET-28a(+)-vp2-C/BL21进行表达,获得3段vp2蛋白,分别命名为vp2-A、vp2-B、vp2-C。经SDS-PAGE鉴定结果表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小依次为50 ku、48 ku、48 ku,与预期蛋白大小一致。经Western blot分析,vp2-A、vp2-B、vp2-C与His-Tag单抗发生特异性结合,证明其具有较好的反应原性。25型蓝舌病病毒vp2蛋白的分段表达为vp2蛋白的功能研究和制备蓝舌病的诊断试剂奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒 25型 vp2蛋白原核表达鉴定

鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中的分泌表达及免疫原性分析

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中国兽医杂志 2020年第12期56卷 14-17,23,I0002页

作者：洪家兵王萍王晓玥于非可刘文晓李永清江西农业大学动物科学技术学院江西南昌330045 北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京海淀100097 北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室北京昌平102206

根据杆状病毒表达系统的密码子偏好性,对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)vp 2基因序列进行密码子优化,然后合成序列。优化后的序列被定向克隆至转移载体pFast Bac^(TM)1,转化DH10Bac^(TM)感受态细胞获取重组杆状病毒穿梭质粒,转染昆虫细胞SF9... 详细信息

根据杆状病毒表达系统的密码子偏好性,对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)vp 2基因序列进行密码子优化,然后合成序列。优化后的序列被定向克隆至转移载体pFast Bac^(TM)1,转化DH10Bac^(TM)感受态细胞获取重组杆状病毒穿梭质粒,转染昆虫细胞SF9,获得P0代重组杆状病毒。间接免疫荧光鉴定和Western blot分析结果显示,病毒reBac-vp2感染昆虫细胞后,能够在昆虫细胞的上清中稳定表达vp2蛋白,而且能够与IBDV的抗体发生特异性结合,具有良好的免疫原性。本试验成功构建了能够分泌表达vp2蛋白的重组杆状病毒,为IBDV诊断试剂及亚单位疫苗研发提供了工具。

关键词：鸡传染性法氏囊病病毒杆状病毒蜂毒肽 vp2蛋白

鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白及其疫苗的研究进展

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河南农业科学 2016年第3期45卷 20-23页

作者：韩玉婷何勇许革学朱艳平马秀园王选年河南科技学院动物科学学院河南新乡453003 新乡学院生物技术研究中心/生命科学与技术系河南新乡453003 灵宝市畜牧局河南灵宝472542

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是鸡传染性法氏囊病(IBD)的病原。近年来IBDV变异毒株和超强毒株的流行,严重威胁着世界养鸡业的发展,传统疫苗已不能控制IBDV的流行,迫切需要研制新型疫苗。IBDV vp2蛋白是重要的结构蛋白,能诱导机体产生中和抗... 详细信息

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是鸡传染性法氏囊病(IBD)的病原。近年来IBDV变异毒株和超强毒株的流行,严重威胁着世界养鸡业的发展,传统疫苗已不能控制IBDV的流行,迫切需要研制新型疫苗。IBDV vp2蛋白是重要的结构蛋白,能诱导机体产生中和抗体,因此,利用vp2蛋白制备IBDV重组疫苗成为国内外研究的热点。综述了IBDV vp2蛋白的作用及在不同表达系统中用vp2蛋白制备疫苗的研究进展,以期为IBDV新型疫苗的开发提供参考。

关键词：鸡传染性法氏囊病病毒 vp2蛋白疫苗