检索结果-南通市图书馆

作者：范宇清郑州大学

学位级别：硕士

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的以侵害雏鸡淋巴组织，特别是中枢免疫器官——法氏囊为主要特征的传染病，每年给养禽业带来巨大经济损失。该... 详细信息

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的以侵害雏鸡淋巴组织，特别是中枢免疫器官——法氏囊为主要特征的传染病，每年给养禽业带来巨大经济损失。该病不仅会造成机体组织损伤，还会引起免疫抑制，降低机体的免疫防御能力，从而导致疫苗免疫接种失败。近年来，由于各地出现的IBDV变异株和超强毒株，现行疫苗免疫不足以应对这些新出现的挑战，造成IBD的流行情况呈现更为复杂的态势，给该病的防控造成较大困难。IBDV的vp2蛋白是该病毒粒子的主要结构蛋白，包含主要保护性抗原表位，因此vp2蛋白的重组表达和相关研究能够为IBDV的防治以及新型亚单位疫苗的开发提供有益的技术支撑和理论依据。本文参照IBDV-vp2标准基因序列，利用Java CodonAdaptation Too（lJCAT）软件对IBDV-B87株碱基密码子进行优化，合成目的基因，目的基因与pUC-57克隆载体连接为pUC57-vp2，双酶切pUC57-vp2和pET28a，提取目的基因并将目的基因与pET-28a表达载体连接，构建重组表达质粒pET28a-vp2，将其转化至BL21(DE3)Plyss表达宿主菌，用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明目的蛋白出现在48ku处，并且主要以可溶性表达为主，与该蛋白理论上的分子量大小一致，并且目的蛋白表达量约占总蛋白表达量的10%。Western blot实验证明vp2蛋白可以被His单抗识别。本研究vp2蛋白的成功表达为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病毒 vp2蛋白原核表达

蓝舌病病毒3型vp2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

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蓝舌病病毒3型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

作者：孙晶中国农业科学院

学位级别：硕士

蓝舌病(Bluetongue disease, BT)是由蓝舌病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的非接触性虫媒传染病。绵羊、山羊、牛等家畜和野生反刍动物对该病毒易感,由于感染的血清型不同其临床表现也不尽相同,主要临床症状为高热、舌头变蓝和口腔粘... 详细信息

蓝舌病(Bluetongue disease, BT)是由蓝舌病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的非接触性虫媒传染病。绵羊、山羊、牛等家畜和野生反刍动物对该病毒易感,由于感染的血清型不同其临床表现也不尽相同,主要临床症状为高热、舌头变蓝和口腔粘膜水肿出血等。BTV主要分布在热带、亚热带和温带国家,与其节肢动物宿主的分布范围一致,该病毒主要通过库蠓等的叮咬进行传播。BTV属于呼肠孤病毒科环状病毒属,病毒粒子呈二十面体对称,无囊膜。该病毒的基因组由10个分节段的双链RNA组成,编码7种结构蛋白(vp1～vp7)和5种非结构蛋白(NS1～NS4和NS3a)。vp2和vp5蛋白构成了病毒的外层衣壳,其中vp2是主要型特异性抗原,对蓝舌病的血清型起决定性作用。本研究根据Genbank中已登录的血清3型蓝舌病病毒(BTV3) L2基因的OFR序列(登陆号：***585124)设计一对特异性引物,从感染BTV3的BHK-21细胞沉淀中提取RNA,然后进行RT-PCR扩增L2基因;将扩增后的L2基因分别克隆到原核表达载体pMal-c4X和真核表达载体pFastBacHTA上,获得原核重组vp2蛋白MBP-vp2和真核重组vp2蛋白His-vp2。为制备抗BTV3vp2蛋白的单克隆抗体(MAb),用pMAL-C4X原核表达系统表达、纯化的重组vp2蛋白MBP-vp2免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,以并以Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达、纯化的重组vp2蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出两株稳定分泌抗BTV3vp2蛋白的MAb杂交瘤细胞株,分别命名为2F8和4E8。分别用western-blot和间接免疫荧光(IFA)对2F8和4E8进行鉴定,western-blot鉴定结果表明2F8和4E8都可以与BTV3的vp2蛋白反应;IFA鉴定结果表明,2F8和4E8都可以与BTV3发生特异性反应,但是与其他血清型BTV (BTV1-2,4-24)不反应。利用肽扫描技术,表达重叠短肽对2F8和4E8的抗原表位进行鉴定,其中2F8识别的表位为466EMIQSVIDDGWDQ478,4E8识别的抗原表位为5(?)SQVFPSYYNKWT520°将MAb2F8和4E8所识别的抗原表位序列与其他血清型的BTV vp2蛋白相应区段进行Blast比对结果表明,2F8和4E8的抗原表位是BTV3vp2特异性的抗原表位,与其他血清型的BTV同源性较低。我国目前尚没有针对BTV3vp2蛋白制备特异性单克隆抗体的相关报道,本研究制备的两株单克隆抗体以及对其针对的抗表位的研究,为了解BTV3vp2蛋白的结构和功能奠定了一定的基础并且为研究表位疫苗提供一定的物质储备。

关键词：血清3型蓝舌病病毒 vp2蛋白单克隆抗体抗原表位

鸡传染性贫血病毒vp1、vp2蛋白的表达及vp2蛋白单克隆抗体的制备

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鸡传染性贫血病毒VP1、VP2蛋白的表达及VP2蛋白单克隆抗体的制备

作者：汪铭锐扬州大学

学位级别：硕士

鸡传染性贫血病是由鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）引起,以雏鸡再生障碍性贫血以及全身性淋巴组织萎缩为特征的免疫抑制病。该病分布于全球,是阻碍禽类养殖业发展的重要免疫抑制病之一。CIAV的基因组只有约2... 详细信息

鸡传染性贫血病是由鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）引起,以雏鸡再生障碍性贫血以及全身性淋巴组织萎缩为特征的免疫抑制病。该病分布于全球,是阻碍禽类养殖业发展的重要免疫抑制病之一。CIAV的基因组只有约2.3kb,共编码三个蛋白。vp1作为其唯一的衣壳蛋白,在CIAV诱导宿主产生中和抗体的过程中具有关键性作用。vp2被认为是vp1的一种辅助蛋白或者支架蛋白,帮助vp1蛋白正确折叠,具有双特异性磷酸酶活性,在CIAV的感染中具有重要的作用。vp3则作为一种凋亡素具有诱导细胞凋亡的功能,在医疗领域被广泛研究。本论文就CIAV vp1、vp2蛋白在杆状病毒系统中的表达、CIAV vp2蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备、CIAVvp2蛋白抗原表位的鉴定三个方面进行研究。研究结果对CIAV重组亚单位疫苗的研发、检测方法的建立、CIAV的防控以及vp2蛋白相关功能的深入研究都具有重要意义。1.鸡传染性贫血病毒vp1、vp2蛋白在杆状病毒中的表达为探究不同表达方式下vp1与vp2蛋白在杆状病毒中表达情况,本研究利用PCR技术扩增出CIAV的vp1、vp2基因,并在vp1与vp2基因之间加入柔性肽序列作为linker,连接到 pFastBacHTA 载体,分别构建 pFastBacHTA-vp1、pFastBacHTA-vp2、pFastBacHTA-vp 1-linker-vp2三种重组供体质粒;将重组质粒转座DH10Bac感受态细胞,获得重组杆粒,并分别转染至Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-vp1、rBac-vp2、rBac-vp1-linker-vp2。IFA 和Western-blot 结果证明,以 rBac-vp1 或 rBac-vp2 单独感染的Sf9中,vp1或vp2蛋白成功表达;以rBac-vp1和rBac-vp2共感染的Sf9细胞中,vp1和vp2蛋白均成功表达;以rBac-vp1-linker-vp2感染的Sf9细胞中,融合蛋白vp1-linker-vp2成功表达。该结果为CIAV亚单位的疫苗研发以及CIAV的防控提供物质基础。2.鸡传染性贫血病毒vp2蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备为制备针对vp2蛋白的单克隆抗体,本研究将CIAV vp2的基因克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-vp2。将重组质粒转化入BL21（DE3）感受态细胞,阳性转化菌在0.1mM的IPTG浓度下,37℃诱导4h重组蛋白获得表达;将获得表达的样品超声波破碎后进行SDS-PAGE分析,结果得到大小约50kDa的重组蛋白。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠,四次免疫后取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合,以rBac-vp2感染的Sf9细胞以及转染pCAGGS-vp2-Flag的DF1细胞进行IFA筛选,结果成功获得了两株稳定分泌针对CIAV vp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名CIAV-vp2-4A12和CIAV-vp2-6B5。Western-blot结果显示两株单抗与不同系统表达的vp2蛋白均反应良好,为研究vp2蛋白的新型抗原表位提供了材料。3.鸡传染性贫血病毒vp2蛋白抗原表位的鉴定以研究内容二中所制备的IFA效价较高的单克隆抗体CIAV-vp2-4A12为研究对象,利用pET-32a作为表达载体将vp2蛋白逐步截短表达,以Western-blot验证不同截短蛋白与单抗CIAV-vp2-4A12的反应情况。结果表明,单克隆抗体CIAV-vp2-4A12识别的最短抗原表位为155KTVRW159。选取GenBank中23株国内外CIAV毒株进行保守性分析,发现该表位在不同毒株间高度保守,为vp2蛋白功能的研究以及CIAV的监测奠定基础。

关键词：鸡传染性贫血病毒 vp1蛋白 vp2蛋白单克隆抗体抗原表位

口蹄疫病毒vp2蛋白诱导细胞自噬的分子机制研究

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口蹄疫病毒VP2蛋白诱导细胞自噬的分子机制研究

作者：张淑敏中国农业科学院

学位级别：硕士

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是一种急性、高度接触性传染病,其发病动物主要为偶蹄目动物。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)是口蹄疫的病原体,属于小RNA病毒科、口蹄疫病毒属,单股正链RNA病毒。口蹄疫病毒的高度... 详细信息

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是一种急性、高度接触性传染病,其发病动物主要为偶蹄目动物。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)是口蹄疫的病原体,属于小RNA病毒科、口蹄疫病毒属,单股正链RNA病毒。口蹄疫病毒的高度接触性传染能够造成巨大经济损失,在世界范围内被广泛关注。自噬(Autophagy)是一种依赖于溶酶体的高度保守的胞内代谢途径,降解细胞内不需要的生物大分子物质及受损细胞器,在细胞生长、发育、维持稳态等方面起重要作用。研究表明自噬参与多种疾病的调控,同时自噬的调控也受许多信号通路分子的影响。本实验室之前研究发现口蹄疫病毒及其灭活病毒都能够诱导自噬发生,但是口蹄疫病毒的哪些蛋白对其诱导自噬起重要作用,及其诱导自噬的分子机制目前尚未有报道。本研究旨在探索口蹄疫病毒核衣壳蛋白能否诱导其宿主细胞PK-15发生自噬及其诱导自噬的分子机制。首先在口蹄疫病毒宿主细胞PK-15内表达口蹄疫病毒的核衣壳蛋白,通过激光共聚焦显微镜技术、蛋白免疫印迹技术(Western blotting),发现表达vp2蛋白的PK-15细胞内自噬标志蛋白LC3B-II的表达水平显著升高,表明vp2蛋白能够显著诱导自噬的发生。进一步研究其诱导自噬的分子机制,发现口蹄疫病毒核衣壳蛋白vp2能够通过激活EIF2S1-ATF4信号通路,抑制AKT-MTOR信号通路诱导自噬的发生;并且AKT-MTOR通路的抑制依赖于EIF2S1-ATF4通路的激活;接着我们利用免疫沉淀结合液相/质谱联用技术对口蹄疫病毒vp2蛋白与宿主细胞内的相互作用蛋白进行研究,结果表明:口蹄疫病毒vp2蛋白能够与宿主细胞PK-15内HSPB1蛋白相互作用;最后,分析了HSPB1蛋白对vp2蛋白诱导自噬的影响,在PK-15细胞内表达vp2蛋白时分别过表达HSPB1蛋白或者敲低HSPB1基因,通过Western blotting实验检测EIF2S1-ATF4通路和AKT-MTOR通路的变化,结果显示:在表达口蹄疫病毒vp2蛋白时,过表达HSPB1蛋白,EIF2S1-ATF4通路被抑制,AKT-MTOR通路被激活,从而下调vp2蛋白诱导的自噬;相反,敲低HSPB1基因后,EIF2S1-ATF4通路进一步被激活,而AKT-MTOR通路进一步被抑制,从而上调vp2蛋白诱导的自噬。在本研究中,首次发现口蹄疫病毒核衣壳蛋白vp2与细胞内HSPB1蛋白相互作用,通过激活EIF2S1-ATF4通路而抑制AKT-MTOR通路,诱导自噬的发生。这项研究为口蹄疫病毒的致病机制基础研究和口蹄疫的防控机制提供新的思路。

关键词：口蹄疫病毒自噬 HSPB1蛋白 vp2蛋白

鸡传染性法氏囊病毒vp2蛋白B细胞结合表位的研究

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鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白B细胞结合表位的研究

作者：李姣郑州大学

学位级别：硕士

传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)是引起鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)的致病病原体,主要侵害雏鸡中枢免疫器官-法氏囊,对B淋巴细胞造成损伤从而引起严重的免疫抑制,受到IBDV侵害的雏鸡易感... 详细信息

传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)是引起鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)的致病病原体,主要侵害雏鸡中枢免疫器官-法氏囊,对B淋巴细胞造成损伤从而引起严重的免疫抑制,受到IBDV侵害的雏鸡易感染其它传染病并有可能导致疫苗接种失败,给家禽养殖业造成巨大损失。IBDV主要衣壳蛋白vp2组成病毒颗粒的表面并携带有中和性抗原表位。研究表明:vp2蛋白253、279、284位氨基酸残基突变不仅导致IBDV强毒株与弱毒株的不同,更是弱毒能在鸡胚成纤维细胞及Vero细胞等非B淋巴细胞上增殖的原因,因此推测三个位点氨基酸残基的突变可能影响了病毒颗粒与细胞受体的结合。为揭示IBDV vp2蛋白与其易感细胞受体结合的特性,本研究在对vp2蛋白进行生物信息学分析的基础上,将vp2蛋白分为相互重叠的6个片段(A、B、C、B1、B2、B3)。以本实验室保存的vp2基因为模板,PCR扩增得到了六个重叠片段的基因,并以vp2全长片段为阳性对照,包装T7噬菌体,并对重组噬菌体进行鉴定。挑选出的阳性噬菌体经PEG沉淀纯化后,用FITC标记,并与3～6周龄雏鸡法氏囊B细胞、Vero细胞结合。荧光显微镜观察结果显示:展示有vp2全长蛋白、vp2高变区B肽段及覆盖B的三段多肽B1、B2、B3的T7噬菌体均能于B细胞及Vero细胞结合,流式细胞术分析结果表明各片段结合B细胞的强度均大于Vero细胞,但vp2与B2的结合能力强与其他片段。表明vp2蛋白高变区是结合细胞受体的部位,而B2(覆盖253、279、284位氨基酸残基)对其结合有重要作用。因此vp2蛋白结合细胞受体的表位可能分布在高变区不同的区域,通过空间折叠形成的三维结构中相互聚集而形成一结合区域,但也可能结合表位只分布在B2上,B1、B3与细胞受体较弱的亲和力来自与B2相互重叠的区域。为进一步验证vp2蛋白片段与细胞受体结合的特性,将vp2蛋白及B片段基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1,稳定转染COS7细胞,用Ni-NTA亲和柱纯化重组蛋白,与B细胞及Vero细胞结合。结果显示阳性细胞能表达较好的绿色荧光,但重组蛋白与细胞作用后未发现荧光。可能是纯化过程中GFP蛋白失活导致荧光消失,或纯化的蛋白量太少,不能满足结合所需。重叠多肽扫描技术是鉴定配体表位及蛋白质相互作用的常用技术之一。本实验根据B2的氨基酸序列及空间结构特点,设计六条重叠多肽,Fmoc固相合成法合成并通过质谱仪鉴定。将六条多肽分别与B细胞及Vero细胞结合,再用荧光标记的展示有vp2蛋白的重组T7噬菌体与之作用,筛选出能有效抑制vp2蛋白与细胞受体结合的多肽。流式细胞术分析的结果表明多肽5t与6t对vp2结合细胞的抑制效果在B细胞与Vero细胞中均较为明显。在125μg/mL的时候就能显著抑制vp2与细胞的结合。两多肽重叠区含盖有关键氨基酸284位T,说明该氨基酸与B细胞及Vero细胞受体的结合是有关的。4n与细胞有一定的结合能力,这可能与该肽同样含有284位T有关,但其周围的氨基酸序列长短的不同影响了它与受体的结合。此外1h对B细胞有一定的抑制,而对Vero却不明显。本研究初步鉴定了强毒株IBDV vp2蛋白与细胞受体结合的可能性表位所在区,为从分子水平揭示病毒与宿主细胞的相互关系以及疫苗和多肽药物的开发提供了一定的理论基础。

关键词：鸡传染性法氏囊病毒 vp2蛋白结合表位 T7噬菌体展示重叠多肽扫描

A型塞内卡病毒vp2蛋白原核表达及血清学检测方法的建立

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A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及血清学检测方法的建立

作者：申珊河北农业大学

学位级别：硕士

A型塞内卡病毒(Seneca VriusA,SVA)属于小RNA病毒科塞内卡病毒属,对猪具有传染性和致病性。症状类似于口蹄疫、猪传染性水疱病和猪水泡性口炎,成年猪感染初期出现嗜睡、厌食和发热,随后鼻镜部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位出现大小不一的... 详细信息

A型塞内卡病毒(Seneca VriusA,SVA)属于小RNA病毒科塞内卡病毒属,对猪具有传染性和致病性。症状类似于口蹄疫、猪传染性水疱病和猪水泡性口炎,成年猪感染初期出现嗜睡、厌食和发热,随后鼻镜部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位出现大小不一的水疱,严重者造成溃烂和跛行。7日龄以内的仔猪死亡率高达70%,偶尔伴有腹泻症状。2014-2015年SVA给巴西养猪业造成严重经济损失,同年SVA首次出现在我国广东地区,属于新型外来病。常用检测方法有病毒的分离鉴定、常规RT-PCR、荧光定量RT-PCR、病毒中和试验、利用表达SVA蛋白构建ELISA等。SVA只有一个阅读框,vp1、vp2和vp3构成该病毒的衣壳蛋白。研究表明,以vp2蛋白作为包被抗原的ELISA检测方法其特异性和灵敏度优于包被抗原为vp1蛋白或vp3蛋白。本试验利用构建的SVA-vp2蛋白作为抗原,建立SVA血清抗体间接ELISA和均相光激化学发光免疫技术(AlphaLISA)检测方法,为SVA-vp2蛋白的免疫原性的研究及SVA血清学检测试剂盒和基因工程疫苗研究奠定基础。本试验根据SVA分离株GD01/2017中的vp2基因,利用pet-30a载体特性和蛋白特点进行引物设计与合成。用RT-PCR成功扩增出大小为870 bp的vp2基因片段,经过克隆转化得到阳性质粒并名为pet30a-vp2重组质粒。随后将重组质粒转入Rosetta(DE3)大肠杆菌中,经过优化诱导温度和时间,在18℃ 12 h成功表达出大小为47KDa的vp2蛋白,同时蛋白质属于部分可溶性蛋白,利用Ni柱亲和层析法进行非变性蛋白纯化,得到高纯度vp2蛋白质,应用Western-blot方法检测vp2蛋白具有免疫反应原性。以纯化后vp2蛋白作为包被抗原,构建间接ELISA方法。用方阵滴定法确定vp2蛋白包被量为2 μg/ml,标准阳性血清最适稀释倍数为1:20。反应条件优化结果,最佳封闭液为2%BSA封闭液,酶标IgG最适稀释度为1:5 000,TMB底物显色液室温避光显色反应10 min。该方法检测灵敏度为1:160;特异性试验结果显示,同猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胸膜肺炎(APP)的阳性血清均无交叉反应;批间、批内重复性试验结果,变异系数均小于10%;对200份临床血清样本检测结果显示,该方法同中和试验(VNT)的符合率为95.5%。将纯化的vp2蛋白经过生物素标记,并建立AlphaLISA方法。对反应条件优化结果显示,总反应体系为25μL,总反应时间为2h。该方法检测灵敏度为1:320;特异性试验结果显示,同FMDV、PRRSV、CSFV、PRV、APP和PEDV 阳性血清均无交叉反应;重复性试验结果,变异系数均小于10%。本试验成功表达出可溶性vp2蛋白,初步建立检测SVAvp2抗体的间接ELISA和AlphaLISA血清学方法,均有较好的特异性、灵敏性和稳定性。

关键词： A型塞内卡病毒 vp2蛋白间接酶联免疫吸附试验均相酶联免疫分析

表达密码子优化犬细小病毒vp2蛋白重组犬瘟热弱毒疫苗株的构建

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表达密码子优化犬细小病毒VP2蛋白重组犬瘟热弱毒疫苗株的构建

作者：秦立得中国农业科学院

学位级别：硕士

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)引起的传染犬科动物的,高度接触性、致死性疾病,以出血性肠炎和亚急性心肌炎为特征。犬细小病毒病主要通过粪-口途径传播,幼犬最易感染。目前,犬细小病毒病已经在我国广泛流行,严重... 详细信息

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)引起的传染犬科动物的,高度接触性、致死性疾病,以出血性肠炎和亚急性心肌炎为特征。犬细小病毒病主要通过粪-口途径传播,幼犬最易感染。目前,犬细小病毒病已经在我国广泛流行,严重威胁着我国的养犬业和皮毛动物养殖业。疫苗接种是防控犬细小病毒病的最有效方法。犬细小病毒病灭活疫苗只能诱导一个短期的免疫反应;由于新的抗原变异毒株的出现,弱毒疫苗接种有时会出现免疫失败。随着反向遗传技术的发展和成熟,单股负链RNA病毒成为了疫苗载体的研究热点。犬瘟热(Canine distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)引发的感染多种动物的急性致死性传染病,给我国的犬养殖业和毛皮动物业造成了严重的损失。目前,全世界应用最为广泛的犬瘟热疫苗是弱毒疫苗。利用犬瘟热弱毒疫苗为载体,研制犬细小病毒病、犬瘟热二联活载体疫苗,可实现一苗两防,降低疫苗生产成本,也可针对新出现的抗原变异亚型毒株快速地进行疫苗更新。按照哺乳动物的密码子偏好性对外源抗原蛋白基因进行密码子优化,能够提高该蛋白在哺乳动物体内或细胞内的表达量,为提高疫苗的免疫效力提供了新的方法。本研究,利用本实验已建立的CD弱毒疫苗株CDV/R-20/8的反向遗传技术平台,构建了表达密码子优化CPV vp2蛋白的重组犬瘟热病毒r20/8-CPVvp2opti。免疫荧光实验和Western blot实验表明,重组病毒r20/8-CPVvp2opti感染的BHK-21细胞中,CPV vp2蛋白得到了正确表达。重组病毒r20/8-CPVvp2opti保持了亲本毒株r20/8在Vero细胞上的生长特性,经实验测定具有生长滴度高的特点,其最高生长滴度可达到106.75 TCID50/ml。Western blot证实,密码子优化可显著提高CPVvp2蛋白在重组犬瘟热病毒r20/8-CPVvp2opti感染细胞中的表达量。以表达密码子优化CPVvp2蛋白重组犬瘟热病毒r20/8-CPVvp2opti表达野生型CPVvp2蛋白重组犬瘟热病毒r20/8-CPVvp2和亲本毒株r20/8分别按104.5TCID50/100μl/只的剂量以肌肉注射的方式,两次免疫接种小鼠。r20/8-CPVvp2opti、r20/8-CPVvp2r20/8免疫小鼠,均诱导低水平的CDV中和抗体反应,且3组免疫小鼠血清中CDV中和抗体滴度无显著性差异;然而,r20/8-CPVvp2opti、r20/8-CPVvp2免疫小鼠,均可诱导显著的CPV血凝抑制(HI)抗体反应,加强免疫后1周,CPV HI抗体反应显著增强,且r20/8-CPVvp2opti免疫小鼠血清中CPV HI抗体滴度显著地高于r20/8-CPVvp2免疫小鼠免疫小鼠血清中CPV HI抗体滴度。结果表明,利用密码子优化CPV vp2蛋白基因构建CPV、CDV活载体疫苗,能增强在免疫动物体内诱导的CPV HI抗体反应,有助于提高该疫苗抗CPV感染的免疫效力。本研究结果表明,表达密码子优化CPV vp2蛋白重组CDVr20/8-CPVvp2opti具有良好的免疫原性,具有作为预防犬细小病毒病和犬瘟热二联活载体疫苗的潜力。

关键词：犬细小病毒 vp2蛋白犬瘟热弱毒疫苗株重组病毒免疫原性

表达鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白的重组鸭肠炎病毒疫苗研究

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表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组鸭肠炎病毒疫苗研究

作者：魏朋华中国农业科学院

学位级别：硕士

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雏鸡急性、高度接触性和免疫抑制性的重要传染病,使感染病毒的鸡群对其它细菌或者病毒的易感性增加,并导致疫苗免疫失败,给我国养禽业造成巨大的经济损失。目前,VAXXITEK(HVT+IBD... 详细信息

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雏鸡急性、高度接触性和免疫抑制性的重要传染病,使感染病毒的鸡群对其它细菌或者病毒的易感性增加,并导致疫苗免疫失败,给我国养禽业造成巨大的经济损失。目前,VAXXITEK(HVT+IBD-vp2)病毒载体疫苗是临床上控制传染性法氏囊病最有效的手段,但该疫苗的储存条件高,需要在液氮的条件下保存和运输,造成疫苗实际应用上的不便,因而,研发一种易储存的有效安全的IBDV载体疫苗显得尤为迫切。鸭肠炎病毒属于禽疱疹病毒,其病毒基因组非常大,含有很多复制非必需区,可供外源片段插入的位点多,能容纳较大的外源基因且不丧失其感染性;病毒具有严格的宿主特异性,安全性好,同时启动细胞和体液免疫,且保存方便。前期研究中,我们拯救获得了一株在UL23基因和US10基因处同时插入外源片段的鸭肠炎病毒疫苗株,该病毒对鸡具有良好的安全性。鉴于此,本研究在此病毒基础上,构建表达IBDV流行株的vp2蛋白的重组病毒,并鉴定该病毒的生物学特性和评估免疫效力。首先,我们分离了一株IBDV流行株(2018年),通过vp2基因进化树分析,结果表明该流行株的vp2基因位于IBDV超强毒株分支内,且与IBDV变异株共同流行于现地鸡群中。接着,我们拯救获得了表达这株IBDV vp2蛋白的重组鸭肠炎病毒,复制能力与亲本病毒相当,且在15代内遗传稳定。用原核蛋白系统表达了IBDV vp2蛋白,并制备了其鼠源的高免血清,该血清用于IFA和Western blot检测重组病毒vp2蛋白,结果表明该重组病毒高效表达IBDV vp2蛋白。最后,使用这株表达IBDV vp2蛋白的重组鸭肠炎病毒免疫1日龄SPF鸡,在免疫后第三周攻毒IBDV BC6/85毒株,以评估该疫苗的免疫效力。抗体水平结果表明,鸭肠炎病毒抗体水平从免疫后第二周开始全部转阳,且在第三周达到高水平(PI%高于80%);然而IBDV vp2抗体水平几乎为阴性,只有一只鸡的血清(1/7)在免疫后第三周转阳。免疫鸡只均未出现任何IBDV的临床症状,解剖后各组织都呈现正常,包括IBDV易感的法氏囊组织。进一步地,用RT-PCR检测法氏囊组织中的病毒vp1基因,结果显示对照攻毒组均能检测到IBDV vp1基因,而免疫攻毒组鸡只未能检测到病毒vp1基因。以上这些结果表明,本研究制备的这株表达IBDV vp2蛋白的重组鸭肠炎病毒可完全保护1日龄SPF鸡免受IBDV BC6/85的攻击,保护率为100%,为研制鸡传染性法氏囊病的病毒载体疫苗提供了理论依据,为研制以鸭肠炎病毒为载体的多价禽用疫苗提供基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 vp2蛋白鸭肠炎病毒载体疫苗免疫效力

表达鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白的重组禽腺病毒的构建

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表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组禽腺病毒的构建

作者：刘如欣山东大学

学位级别：硕士

禽腺病毒血清型 4 型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)毒株CH/HNJZ/2015是2015年分离自我国河南的一株高致病性流行病毒株,属于禽腺病毒属中的C种,是一种没有囊膜包裹的双股DNA病毒,是肝炎-心包积液综合征(Hepatitis-hydropericardi... 详细信息

禽腺病毒血清型 4 型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)毒株CH/HNJZ/2015是2015年分离自我国河南的一株高致病性流行病毒株,属于禽腺病毒属中的C种,是一种没有囊膜包裹的双股DNA病毒,是肝炎-心包积液综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)的主要病原,但其致病机理尚不明确,许多未知基因的功能还有待进一步研究,因此有必要建立针对FAdV-4 CH/HNJZ/2015毒株的反向遗传操作体系,以帮助这些问题得到解决。此外,腺病毒具有病毒粒子相对稳定、致病力低、宿主范围广、遗传操作较容易、病毒滴度高、易于储存以及能装载较大外源基因等优点,在基础研究、疫苗研发、基因治疗等方面被广泛研究和应用,被认为是基因转移中最有潜力的载体之一。鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD),是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引发的一种高致死率的传染性疾病,鸡感染该病毒后导致免疫器官法氏囊严重受损,使机体对免疫应答产生抑制作用而死亡。鸡传染性法氏囊病自1957年被发现以来,在世界多个国家和地区流行,与鸡新城疫病、鸡马立克氏病并列为危害全球家禽健康的三大传染病,其高死亡率给全球的养禽业造成了巨大的经济损失。在本研究中,通过ExoCET直接克隆技术构建了 FAdV-4 CH/HNJZ/2015毒株的全长基因组感染性克隆。并利用无缝定点改造技术在CH//HNJZ/2015的外源基因插入位点插入鸡传染性法氏囊病病毒的抗原基因vp2构建重组禽腺病毒。研究成果如下:1.禽腺病毒4型毒株CH/HNJZ/2015反向遗传体系的建立ExoCET直接克隆技术将核酸外切酶介导的体外同源重组和RecET介导的细胞内同源重组有效结合,可以快速、高效地对大片段DNA进行直接克隆。利用ExoCET直接克隆技术对FAdV-4高致病性毒株CH/HNJZ/2015基因组进行直接克隆,将其基因组克隆到了 p15A载体上,得到了含有完整病毒基因组的感染性克隆,并成功地进行了病毒拯救,首次建立了禽腺病毒4型CH/HNJZ/2015毒株的反向遗传体系,方便对其进行基因修饰和改造,为FAdV-4新型流行毒株的基因功能、致病机理等研究提供了有力的工具。2.插入鸡传染性法氏囊病病毒的抗原基因构建重组禽腺病毒质粒禽腺病毒可以容纳较大的基因片段,是一种良好的病毒载体,通过无缝定点改造技术,在CH/HNJZ/2015的外源基因插入位点处插入鸡传染性法氏囊病病毒的抗原基因vp2构建重组禽腺病毒质粒。3.重组禽腺病毒的拯救将构建得到的重组病毒质粒p15A-cm-HNJZ通过限制性酶酶切线性化,转染鸡肝癌细胞(LMH),培养6天后细胞出现明显病变,同时用特异性引物对重组病毒中的vp2基因进行了 PCR扩增,得到的条带与理论值大小一致,表明重组病毒拯救成功。4.重组禽腺病毒中外源基因的表达验证对重组病毒中的外源基因vp2进行了免疫印迹试验检测,得到了与阳性对照大小一致的条带,说明vp2能够在重组病毒中进行正常表达。通过间接免疫荧光试验确定了重组病毒所表达的vp2蛋白在细胞中的位置,结果显示目的蛋白主要在细胞质内。5.重组禽腺病毒的体外复制能力将FAdV-4 CH/HNJZ/2015野生毒株和重组病毒分别感染鸡肝癌细胞,在感染后的不同时刻收获病毒感染的细胞,测定所收获病毒的TCID50,绘制病毒的生长曲线,结果显示重组病毒rHNJZ-1966-IBDV-vp2和FAdV4亲本毒株CH/HNJZ/2015的增殖动态没有明显差异,表明重组病毒rHNJZ-1966-IBDV-vp2在体外复制能力良好。6.重组禽腺病毒的遗传稳定性检测为了检测重组病毒的遗传稳定性,将重组病毒连续传代40次,每10代进行对重组病毒基因组中的vp2基因进行一次PCR检测,结果显示,每一代的重组病毒中均能扩增出与vp2基因大小一致的条带,表明vp2基因能够在重组病毒rHNJZ-1966-IBDV-vp2复制的过程中稳定存在。本研究利用ExoCET直接克隆技术建立了禽腺病毒4型高致病性毒株CH/HNJZ/2015的反向遗传操作体系,为进一步探究未知病毒基因的功能、分子致病机理及其与宿主的互作机制等研究提供了强有效的平台。通过无缝定点改造技术在禽腺病毒CH/HNJZ/2015毒株的外源基因插入位点插入了鸡传染性法氏囊病病毒的抗原基因vp2,构建了重组禽腺病毒质粒,并成功地进行了病毒拯救,且拯救出的病毒能够在体外稳定地复制和遗传,为灭活的重组病毒载体疫苗研究奠定了基础。

关键词：禽腺病毒反向遗传体系鸡传染性法氏囊病病毒 vp2蛋白病毒载体

水貂肠炎病毒vp2蛋白单克隆抗体的制备及胶体金试纸条的研制

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水貂肠炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及胶体金试纸条的研制

作者：林鹏中国农业科学院

学位级别：硕士

水貂病毒性肠炎(Mink viral enteritis)是由水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)引起的一种急性传染病。自然条件下主要特性为剧烈腹泻,幼龄水貂具有较高的发病率和死亡率。随着世界毛皮动物饲养业的快速发展,水貂病毒性肠炎已经成... 详细信息

水貂病毒性肠炎(Mink viral enteritis)是由水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)引起的一种急性传染病。自然条件下主要特性为剧烈腹泻,幼龄水貂具有较高的发病率和死亡率。随着世界毛皮动物饲养业的快速发展,水貂病毒性肠炎已经成为危害水貂养殖业三大疫病之一,给全世界养貂业带来巨大的经济损失。免疫胶体金层析技术(Gold immunochromatography assay,GICA)是免疫层析技术、胶体金标记技术及免疫反应的结合体。胶体金是一种常用的标记技术,以胶体金作为标志物应用抗原、抗体检测的一种新型的检测方法,具有简单快速、结果清晰,可通过肉眼观察、灵敏度高、无污染和携带方便等优点。因此该技术得到了迅速发展,在兽医学领域应用也越来越多。本研究采用竞争法建立检测MEV胶体金试纸条,柠檬酸三钠还原法制备20 nm的胶体金颗粒与抗MEV单克隆抗体合成金标探针。纯化的MEV vp2蛋白包被在NC膜上作为检测线(T线),羊抗鼠IgG包被在NC膜上作为质控线(C线),组装成胶体金层析试纸条。根据水貂肠炎病毒MEVB毒株,设计特异性引物扩增MEV vp2结构蛋白基因获得1 773 bp基因片段;将该基因片段连接到克隆载体上,验证正确后定向连接到原核表达载体PET-30a,构建MEV vp2基因原核表达重组质粒PET-30a-vp2。将该重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3),重组质粒经酶切和测序鉴定正确后进行诱导表达。IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果发现该蛋白在37?C,诱导剂IPTG终浓度为1.0 mmol/L条件下良好表达,鉴定该重组MEV vp2蛋白以包涵体的形式存在,大小约为70 KD,用镍柱纯化后获得较纯的融合蛋白。采用蔗糖密度梯度超速离心法纯化MEVB细胞培养物。经纯化的MEVB毒株免疫BALB/c小鼠,制备脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA方法的筛选,获得6株能稳定分泌抗MEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4、6、8、10、13、14。该6株单克隆抗体分别进行了腹水效价测定,结果为单抗4和13抗体效价为1.28×105,单抗6和14抗体效价为2.56×105,单抗8和10抗体效价为5.12×105;特异性试验鉴定该6株单克隆抗体能与犬细小病毒(CPV)及水貂肠炎病毒(MEV)呈阳性反应,但不与犬瘟热病毒(CDV)、水貂阿留申病毒(AMDV)及犬腺病毒(CAV)发生反应;经亚型鉴定,其中单抗4、10为IgG2b亚型、单抗6为IgG1亚型,单抗8、13、14为IgG2a亚型;间接免疫荧光鉴定该6株单克隆抗体均能使接毒的F81细胞产生绿色荧光;免疫印迹试验结果显示该6株单克隆抗体可在约70 KD处出现特异性反应条带。本试验为MEV的深入研究、快速诊断方法的建立奠定了基础。采用柠檬酸三钠还原法制备出20 nm胶体金颗粒,与抗MEV单克隆抗体10偶联形成金标探针。优化最佳试纸条各项参数,将MEV vp2蛋白以0.8 mg/mL的浓度包被于NC膜上作为检测线(T线),将羊抗鼠IgG以1 mg/mL浓度包被于NC膜上作为质控线(C线)。该胶体金检测试纸条的敏感性为1:64。该试纸条检测MEV和CPV样品为阳性结果,而对CDV、CAV和AMDV等相关病毒样品检测均为阴性结果,说明该试纸条特异性良好。与CPV胶体金试纸条方法符合率可达到94.1%。在4?C和25?C条件下可以保存6个月其敏感性和特异性没有明显的变化。本研究成功的建立检测MEV胶体金试纸条,为早期诊断、预防和控制MEV具有重要的现实意义。

关键词：水貂肠炎病毒 vp2蛋白单克隆抗体免疫胶体金试纸条