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vp0610对副溶血性弧菌生物被膜形成调控机制的初步研究

vp0610对副溶血性弧菌生物被膜形成调控机制的初步研究

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作者：蒋富凤陕西科技大学

学位级别：硕士

副溶血性弧菌是一种广泛存在于温暖沿海水域的革兰氏阴性细菌,该菌可以通过不同途径感染人类,主要与食用被污染的海鲜食品有关。在海鲜等水产品的养殖过程中,通常伴随着各种抗生素和杀菌剂的使用,但是副溶血性弧菌仍然能够被检出,生物... 详细信息

副溶血性弧菌是一种广泛存在于温暖沿海水域的革兰氏阴性细菌,该菌可以通过不同途径感染人类,主要与食用被污染的海鲜食品有关。在海鲜等水产品的养殖过程中,通常伴随着各种抗生素和杀菌剂的使用,但是副溶血性弧菌仍然能够被检出,生物被膜被认为在水产品感染中发挥着重要作用。生物被膜能附着在生物及非生物介质表面,从而引起交叉感染。同时副溶血性弧菌形成生物被膜后具有较强抗逆性,使其具有一定程度的抗消杀能力,进而继续污染食品和食品加工设备。研究副溶血性弧菌生物被膜形成过程,为后续研究基于通路阻断的防控方法提供理论支撑,而目前关于副溶血性弧菌生物被膜形成的研究较少。因此,本研究对课题组前期通过蛋白质组学筛选出的生物被膜相关基因vp0610进行基因敲除以验证该基因功能,并结合pull down蛋白互作技术以及转录组学分析进一步挖掘vp0610在副溶血性弧菌生物被膜形成中的功能。主要研究结果如下:（1）生物信息学分析结果显示vp0610被注释为一个假定蛋白,由204个氨基酸组成,分子量为22.3 kDa,属于YfgM家族蛋白,目前在弧菌中均未发现该家族蛋白的任何报道。利用同源重组技术对vp0610进行基因敲除以及基因回补,并经测序验证成功获得vp0610的敲除株和回补株。结晶紫染色法定量分析表明:24 h前敲除株的生物被膜形成速度大于野生株,但24 h后敲除株的生物被膜形成量不再增加,而野生株的生物被膜形成快速增加,到72 h时,三者的形成量几乎一致,说明vp0610对早期生物被膜形成具有一定的抑制作用。激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜对24 h的生物被膜形成做了进一步观察,证明敲除株的生物被膜形成量高于野生株。（2）通过测定影响生物被膜形成相关因素所对应表型以探究vp0610的作用途径发现:敲除株的游动能力明显大于野生株,说明vp0610对极鞭毛介导的游动能力具有抑制作用,当把vp0610敲除后,这种抑制作用被解除,极鞭毛的运动增加了菌株接触表面的可能性,使得生物被膜形成增加,但爬动能力没有明显差异;敲除株的可溶性多糖含量低于野生株,不可溶性多糖含量显著高于野生株。可溶性多糖通常充当能量物质,表明敲除株的生物被膜中菌体量大说明对能量的消耗也大,不可溶性多糖作为生物被膜的结构物质,其含量与生物被膜测定结果保持一致;c-di-GMP测定结果显示:vp0610对12 h的c-di-GMP产生没有显著影响,但是24 h后敲除株的c-di-GMP产生量显著降低,这解释了 24 h后敲除株的生物被膜形成缓慢增加甚至不再增加的原因。（3）找到vp0610在生物被膜形成中的功能后,本试验继续从蛋白层面研究vp0610的互作蛋白。Pull-down结果显示:vp0610能与180个蛋白发生相互作用,这180个蛋白的GO富集分析发现它们主要参与RNA降解、代谢途径、核黄素代谢、次级代谢产物的生物合成、抗生素的生物合成,其中与生物被膜形成相关的互作蛋白主要涉及群体感应和PTS系统的组分。因此,初步认为vp0610主要通过这两条途径影响生物被膜形成。（4）通过RNA-Seq分析vp0610缺失后对基因转录调控的影响范围,发现12 h时敲除株与野生株相比有598个基因上调,639个基因下调,24h时有197个基因上调,115个基因下调。对这些差异基因进行GO功能富集分析发现:12 h时,显著富集到20个GO Term,主要涉及氧化还原过程、细胞氨基酸的生物合成过程、有机酸的生物合成过程、碳水化合物代谢及运输电子转移以及PTS系统等,PTS是生物被膜调控网络中的重要结构,该系统能够影响弧菌多糖、胞外多糖、c-di-GMP产生和降解以及Ⅳ型菌毛蛋白的表达;24 h时,虽然没有显著富集的GO Term,但是也能够富集到鞭毛依赖性细胞运动。鞭毛在生物被膜初期介导黏附定植,成熟期充当生物被膜支架。KEGG通路分析发现:12 h时显著富集的通路有11条,主要包含群体感应、果糖和甘露糖代谢、脂肪酸降解、碳源代谢和次级代谢产物的生物合成等,而碳源代谢使得胞外的可溶性多糖和不可溶性多糖增加;24 h时显著富集的通路有5条,主要包括缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的降解、丙酸酯代谢、淀粉和蔗糖代谢、脂肪酸代谢和精氨酸生物合成。综上所述,vp0610能够通过作用于磷酸转移酶系统、群体感应系统等通路去影响副溶血性弧菌运动能力、胞外多糖和c-di-GMP产生等,进而负调控早期生物被膜形成。

关键词：副溶血性弧菌生物被膜形成 vp0610 pull-down 转录组测序分析

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