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病毒学报 2019年第1期35卷 134-141页

作者：叶倩汪铭书程安春四川农业大学动物医学院预防兽医研究所成都611130 四川农业大学动物医学院禽病防治与研究中心成都611130 四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室成都611130

小RNA病毒2B蛋白是一种非结构蛋白,其中部分已被证实隶属于viroporin家族,而viroporin是由病毒编码的一类小分子量疏水跨膜蛋白,可通过增大宿主细胞膜结构通透性扰乱其生理学功能而保证病毒完成生命周期。本文主要对小RNA病毒2B蛋白的vi... 详细信息

小RNA病毒2B蛋白是一种非结构蛋白,其中部分已被证实隶属于viroporin家族,而viroporin是由病毒编码的一类小分子量疏水跨膜蛋白,可通过增大宿主细胞膜结构通透性扰乱其生理学功能而保证病毒完成生命周期。本文主要对小RNA病毒2B蛋白的viroporin特性及生物学功能进行阐释,以便加深对小RNA病毒复制及增殖的理解,并为抗病毒药物的研发提供参考。

关键词：小RNA病毒 2B蛋白 viroporin

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猪轮状病毒NSP4及其viroporin调控内质网应激和细胞凋亡的分子机制研究

猪轮状病毒NSP4及其viroporin调控内质网应激和细胞凋亡的分子机...

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作者：建琛瑶西北农林科技大学

学位级别：硕士

轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起幼龄动物和婴幼儿急性肠胃炎的一种常见病原体,特别是在发展中国家,每年可造成约45万名5岁以下儿童死亡。猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原体之一,仔猪感染猪轮状病毒后... 详细信息

轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起幼龄动物和婴幼儿急性肠胃炎的一种常见病原体,特别是在发展中国家,每年可造成约45万名5岁以下儿童死亡。猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原体之一,仔猪感染猪轮状病毒后迅速发生腹泻,严重者常常因脱水而死亡,对畜牧业的发展危害很大。RV非结构蛋白NSP4是一种病毒肠毒素,由175个氨基酸组成,NSP4片段(47-91 aa)具有viroporin的结构特征,NSP4及其viroporin在轮状病毒致病过程中发挥着重要作用。研究发现NSP4(47-91aa)突变体能在内质网形成一个跨膜的水孔,破坏膜的内稳态而增加胞质钙浓度。NSP4及其viroporin可能与轮状病毒诱导的内质网应激和细胞凋亡有关,对轮状病毒NSP4及其viroporin的深入研究,为进一步阐明PoRV致病机理奠定基础,具有重要的公共卫生意义。本研究用猪轮状病毒NSP4及其viroporin真核表达质粒转染细胞,首先检测凋亡因子的变化,确定其引起凋亡,然后检测了内质网应激因子的变化,以探究NSP4及viroporin与内质网应激和细胞凋亡之间的关系,具体研究结果如下:(1)RT-PCR扩增得到猪轮状病毒的NSP4基因和NSP4基因片段(47-91 aa),通过引物设计在它们C端引入Flag标签,并将其连接到pcDNA3.1(+)构建真核表达质粒pcDNA3.1-NSP4-Flag和pcDNA3.1-viroporin-Flag。双酶切鉴定和测序结果与预期结果一致,说明本研究成功构建了NSP4和NSP4片段(47-91 aa)的真核表达质粒。(2)将重组质粒NSP4-GFP和viroporin-GFP转染猪小肠上皮细胞(SIEC),通过荧光倒置显微镜观察和Western blot检测,结果表明NSP4和NSP4片段(47-91 aa)成功表达。DNA ladder是细胞凋亡的特征之一,抽提转染NSP4-GFP和viroporin-GFP的SIEC细胞的DNA,用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示NSP4和NSP4片段(47-91aa)所在泳道出现DNA ladder现象,说明NSP4和NSP4片段(47-91 aa)能诱导SIEC细胞凋亡。为进一步确定NSP4和NSP4片段(47-91 aa)能调控哪些凋亡相关过程,通过荧光定量PCR分析了Bax和Bcl-2的表达,发现NSP4和NSP4片段(47-91 aa)能促进Bax的表达,抑制Bcl-2的表达。Western blot检测发现NSP4和NSP4片段(47-91aa)能促进caspase-3、caspase-8和caspase-9的切割,说明NSP4和NSP4片段(47-91 aa)能够诱导细胞的凋亡。(3)为进一步确定内质网应激是否参与了NSP4和NSP4片段(47-91 aa)诱导的细胞凋亡,检测了GRP78、CHOP、caspase-12、ATF6、ATF4和IERα等多种关键因子的表达。荧光定量PCR和Western blot检测发现NSP4和NSP4片段(47-91 aa)能在mRNA水平和蛋白水平上调GRP78和CHOP的表达。caspase-12、ATF6、ATF4和IERα常参与内质网介导的细胞凋亡,荧光定量PCR和Western blot检测发现NSP4和NSP4片段(47-91 aa)能上调caspase-12、ATF6、ATF4和IERα的表达。这些结果说明NSP4和NSP4片段(47-91 aa)能诱导内质网应激,并且能诱导内质网应激介导的细胞凋亡。综上所述,本研究成功构建了猪轮状病毒NSP4及其viroporin的带Flag标签的真核表达载体;通过实时荧光定量PCR和Western blot检测了NSP4及其viroporin对细胞凋亡的影响,并进一步研究发现该凋亡与内质网应激有密切关系,提示内质网应激也是NSP4诱导凋亡的途径之一,且viroporin有可能是其关键区域。本研究为轮状病毒致腹泻的机制研究提供了新的理论依据。

关键词：猪轮状病毒非结构蛋白NSP4 viroporin 细胞凋亡内质网应激

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1型鸭肝炎病毒非结构蛋白2B的viroporin特性研究

1型鸭肝炎病毒非结构蛋白2B的viroporin特性研究

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作者：叶倩四川农业大学

学位级别：硕士

viroporin是由病毒编码的一类小分子量疏水跨膜蛋白,含有至少一个疏水跨膜区,具有增加宿主细胞膜通透性、扰乱宿主细胞离子平衡、诱导宿主细胞发生凋亡及自噬等功能,通过扰乱宿主细胞生理学功能而保证病毒完成生命周期。小RNA病毒2B蛋... 详细信息

viroporin是由病毒编码的一类小分子量疏水跨膜蛋白,含有至少一个疏水跨膜区,具有增加宿主细胞膜通透性、扰乱宿主细胞离子平衡、诱导宿主细胞发生凋亡及自噬等功能,通过扰乱宿主细胞生理学功能而保证病毒完成生命周期。小RNA病毒2B蛋白是一种非结构蛋白,其中部分已被证实隶属于II型viroporin家族,而1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)2B蛋白的结构特性及生物学功能尚不清楚,本文对此展开相关研究,获得如下结果:1.DHAV-1 2B的跨膜方式2B基因共有357个碱基编码119个氨基酸,经生物学软件预测,含有一个位于第42-63位氨基酸段跨膜区,有较高的疏水性,不含有阳离子双亲α螺旋。对2B全序列及胞外区进行原核表达,结果2B全序列未检测到表达,而2B胞外域截短序列原核表达载体在IPTG终浓度0.6 mmol/L、37℃诱导8 h时以上清形式表达并能被DHAV-1感染鸭血清识别。切胶纯化原核表达的2B截短蛋白并免疫小鼠获得了鼠抗2B多克隆抗体,该抗体可识别DHAV-1感染及真核瞬时表达的2B,可用于DHAV-1及其2B的检测、定位等研究。在2B蛋白的C端和N端分别加入HA与FLAG标签,构建真核表达载体pCAGGS-2B-HA、pCAGGS-FLAG-2B,在鸭胚成纤维细胞(DEF)中表达后用能透化细胞膜及细胞器膜的0.25%Triton X-100和只能透化细胞膜的洋地黄皂苷(0.01mg/mL)透化后进行间接免疫荧光检测,结果0.25%Triton X-100处理后pCAGGS-2B-HA、pCAGGS-FLAG-2B均能检测到荧光,在洋地黄皂苷处理后仅pCAGGS-2B-HA检测到荧光,确定2B蛋白跨膜方式与ⅠA型viroporin一致。2.DHAV-1 2B的生物学功能将pCAGGS-2B-HA转染至DEF细胞中瞬时表达,结果2B蛋白的表达扰乱宿主细胞Ca平衡,引起细胞内Ca浓度上调;通过DAPI观察到核碎裂、核边移、核皱缩等情况,通过DNA Ladder观察到断裂的DNA片段,通过Tunnel法观察到棕褐色的细胞核,且检测到细胞凋亡因子caspase-8的酶活性无变化而caspase-9显著上升,这表明2B蛋白的表达导致宿主细胞凋亡且极可能是通过caspase-9相关的线粒体通路所引起;2B蛋白的表达引起宿主细胞LC3-II/LC3-Ⅰ增加、自噬小的增加,但未导致自噬分解底物SQSTM1/p62蛋白的明显降解,且自噬体与溶酶体不发生共定位,即证实2B蛋白的表达引起宿主细胞自噬,但自噬流发生不完全。综上,DHAV-1的非结构蛋白2B具有能引起宿主细胞Ca的上升、诱导宿主细胞发生凋亡及自噬等viroporin的生物学特性,为ⅠA型viroporin。

关键词： DHAV-1 2B viroporin Ca2+ 凋亡自噬

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COVID-19-associated diarrhea

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World Journal of Gastroenterology 2021年第23期27卷 3208-3222页

作者： Klara Megyeri Áron Dernovics Zaid I I Al-Luhaibi András Rosztóczy Department of Medical Microbiology and Immunobiology University of SzegedSzeged 6720CsongradHungary Division of Gastroenterology Department of Internal MedicineUniversity of SzegedSzeged 6720CsongradHungary

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)recently emerged as a highly virulent respiratory pathogen that is known as the causative agent of coronavirus disease 2019(COVID-19).Diarrhea is a common early symptom in a significant proportion of patients with SARS-CoV-2 infection.SARS-CoV-2 can infect and replicate in esophageal cells and enterocytes,leading to direct damage to the intestinal epithelium.The infection decreases the level of angiotensinconverting enzyme 2 receptors,thereby altering the composition of the gut microbiota.SARS-CoV-2 elicits a cytokine storm,which contributes to gastrointestinal inflammation.The direct cytopathic effects of SARS-CoV-2,gut dysbiosis,and aberrant immune response result in increased intestinal permeability,which may exacerbate existing symptoms and worsen the prognosis.By exploring the elements of pathogenesis,several therapeutic options have emerged for the treatment of COVID-19 patients,such as biologics and biotherapeutic agents.However,the presence of SARS-CoV-2 in the feces may facilitate the spread of COVID-19 through fecal-oral transmission and contaminate the environment.Thus gastrointestinal SARS-CoV-2 infection has important epidemiological significance.The development of new therapeutic and preventive options is necessary to treat and restrict the spread of this severe and widespread infection more effectively.Therefore,we summarize the key elements involved in the pathogenesis and the epidemiology of COVID-19-associated diarrhea.

关键词： COVID-19 Diarrhea Ionic imbalance viroporin Angiotensin-converting enzyme type 2 Leaky gut

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Inhibitor-Based Therapeutics for Treatment of Viral Hepatitis

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Journal of Clinical and Translational Hepatology 2016年第3期4卷 248-257页

作者： Debajit Dey Manidipa Banerjee Kusuma School of Biological Sciences Indian Institute of Technology Delhi Hauz Khas New Delhi India

Viral hepatitis remains a significant worldwide threat,in spite of the availability of several successful therapeutic and vaccination strategies.Complications associated with acute and chronic infections,such as liver failure,cirrhosis and hepatocellular carcinoma,are the cause of considerable morbidity and mortality.Given the significant burden on the healthcare system caused by viral hepatitis,it is essential that novel,more effective therapeutics be developed.The present review attempts to summarize the current treatments against viral hepatitis,and provides an outline for upcoming,promising new therapeutics.Development of novel therapeutics requires an understanding of the viral life cycles and viral effectors in molecular detail.As such,this review also discusses virallyencoded effectors,found to be essential for virus survival and replication in the host milieu,which may be utilized as potential candidates for development of alternative therapies in the future.

关键词： viral hepatitis viroporin Inhibitor

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口蹄疫病毒非结构蛋白2B的离子孔道特性研究

口蹄疫病毒非结构蛋白2B的离子孔道特性研究

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作者：敖大四川农业大学

学位级别：硕士

病毒离子孔道蛋白(viroporins)是由病毒编码的一类小分子量、疏水性跨膜蛋白。它们一般由50-120个氨基酸残基组成,至少有一个疏水性跨膜结构域。这些疏水性跨膜区能够与宿主细胞内的磷脂双分子层相互作用并使磷脂双分子层扩散。离子孔... 详细信息

病毒离子孔道蛋白(viroporins)是由病毒编码的一类小分子量、疏水性跨膜蛋白。它们一般由50-120个氨基酸残基组成,至少有一个疏水性跨膜结构域。这些疏水性跨膜区能够与宿主细胞内的磷脂双分子层相互作用并使磷脂双分子层扩散。离子孔道蛋白参与破坏宿主细胞的形态并扰乱宿主细胞的生理学功能以保证病毒能够完成其完整的生命周期。小RNA病毒科肠道病毒属病毒编码的2B蛋白具有寡聚化形成跨膜孔道、增加宿主细胞膜通透性、扰乱宿主细胞Ca2+体内平衡、诱导宿主细胞发生自噬以及诱导宿主细胞的凋亡等viroporin特性。本研究中,以小RNA病毒科肠道病毒属中的脊髓灰质炎病毒和柯萨奇病毒的2B蛋白研究为参考,借鉴多种病毒离子孔道蛋白的研究方法,对口蹄疫病毒非结构蛋白2B的结构特性和功能展开初步研究。1.运用在线预测软件对2B蛋白氨基酸序列进行预测,结果显示,亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒2B基因含有462 bp,总共编码154个氨基酸。整条肽链拥有两个疏水区,分别为氨基酸83-104和氨基酸119-137。构建pXJ-FLAG-2B, pXJ-2B-HA及pXJ-2BΔ(110-111)等带有不同标签的重组质粒在BHK-21细胞中表达,并采用0.01% TritonX-100和洋地黄皂苷(0.01mg/mL)对细胞的处理,确定了2B蛋白的跨膜方式与ⅡA型viroporin的跨膜方式一致。构建带有绿色荧光标签的重组质粒pEGFPNl-2B在BHK-21细胞中表达,并采用激光共聚焦显微镜的观察,确定了2B蛋白定位于内质网。构建带有SUMO标签的重组质粒pSMK-2B在大肠杆菌C43(DE3)中表达并纯化,经戊二醛作用,2B蛋白单体之间出现了不同程度的寡聚化作用,确定了2B蛋白在细胞外能够相互作用;同时,免疫共沉淀实验显示,带有不同标签的2B蛋白单体间出现寡聚化作用,确定了2B蛋白在BHK-21细胞内也能够相互作用。2B蛋白的这些结构特性与viroporin的一般结构特性相一致。2.通过对比空载体质粒pSMK以及重组质粒pSMK-2B在大肠杆菌BL21(DE3)和C43(DE3)的表达以及两种重组菌株的增殖情况。结果显示,2B蛋白只在毒性耐受性更强的大肠杆菌C43(DE3)菌株中表达,而且与大肠杆菌C43(DE3)相比,大肠杆菌BL21(DE3)的增殖明显受到抑制。这证明了2B蛋白对原核细胞有一定的毒性作用。将重组质粒pXJ-FLAG-2B或pXJ-2B-HA转入BHK-21细胞,2B蛋白在BHK-21细胞中表达后,破坏了细胞膜结构的完整性,并引起了细胞内Ca2+浓度的显著升高。同时,2B蛋白在BHK-21细胞以及H1299细胞中的表达,也显著地引起细胞内LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ的分割以及LC3在细胞内的集聚。也就是说,2B蛋白在BHK-21细胞及H1299细胞中的表达诱发了细胞发生较高水平的自噬。综上所述,口蹄疫病毒编码的非结构蛋白2B具有与viroponn相类似的结构特性,并能够发挥与viroponn相类似的生理功能。这些结果表明,口蹄疫病毒的2B蛋白可能属于viroponn成员。

关键词：口蹄疫病毒 2B蛋白 viroporin 结构特性生物学功能

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