检索结果-南通市图书馆

作者：高宇哲中国农业科学院

学位级别：硕士

布氏杆菌病是五种世界范围内由细菌引起的传染性人兽共患疾病之一,布氏杆菌为革兰氏阴性,无芽孢,兼性厌氧的胞内寄生菌,分为7个种:Brucella melitensis(羊种), Brucella suis(猪种), Brucella abortus (牛种), Brucella ovis(绵羊种), B... 详细信息

布氏杆菌病是五种世界范围内由细菌引起的传染性人兽共患疾病之一,布氏杆菌为革兰氏阴性,无芽孢,兼性厌氧的胞内寄生菌,分为7个种:Brucella melitensis(羊种), Brucella suis(猪种), Brucella abortus (牛种), Brucella ovis(绵羊种), Brucella canis (犬种), Brucella neotomae (沙田鼠种),以及Brucella maris(海洋种)。造成公共卫生危害的主要是羊种、牛种和猪种布氏杆菌,其中以羊种危害最为严重。血清学监测对动物布氏杆菌病的防控和净化具有极为重要的意义。我国目前应用的布氏杆菌疫苗株包括羊种的M5-90,牛种的A19和猪种的S2。这三种疫苗都存在着疫苗免疫反应与自然感染无法区别的问题,对布病防控带来极大的困扰,迫切需要研发新型标记疫苗。virb12基因是布氏杆菌IV型分泌系统中的编码基因之一,而IV型分泌系统已被证明是布氏杆菌主要的毒力因子,有研究表明virb12蛋白位于布氏杆菌细胞表面,并可能在侵染宿主细胞时起重要作用。相关研究表明virb12蛋白能够诱导宿主产生相应抗体,是具有实际应用价值的布氏杆菌病血清学诊断靶抗原。M5-90疫苗株是将羊种M5疫苗株在鸡成纤维细胞上传代90次之后而得到的毒力减弱的疫苗株,在我国得到广泛应用于牛羊的布氏杆菌病防控,其安全性和有效性已经为实践证明。对M5-90疫苗株的virb12基因进行人工缺失,有望获得能够鉴别自然感染和疫苗免疫反应的标记疫苗。为此,本研究首先利用大肠杆菌重组表达了virb12蛋白,作为检测抗原,建立了检测相应抗原的间接ELISA方法。利用该方法检测了60份布氏杆菌阳性山羊血清及30份布氏杆菌阴性山羊血清,检出符合率为91.7%,证明重组virb12蛋白对山羊布氏杆菌病的检测具有良好的特异性和敏感性。进一步采用基因组同源重组方法,构建了virb12基因缺失的M5-90疫苗株(M5-90-virb12)。BALB/c小鼠的毒力残留试验结果显示,M5-90-virb12与M5-90免疫小鼠的脾脏重量与荷菌量的消减趋势基本吻合,表明M5-90-virb12与M5-90的生物安全性没有显著差别。BALB/c小鼠进行的攻毒保护实验结果显示,攻毒后M5-90-virb12和M5-90免疫鼠之间的脾脏重量及荷菌量均无显著差异,且与对照组差异显著。同时在一个月之内监测了M5-90以及M5-90-virb12诱导羊产生的抗体水平,两者无明显差异。说明缺失株M5-90-virb12保持了M5-90疫苗的免疫保护效力。综上,本研究验证了virb12蛋白可以作为布氏杆菌的一种血清学标记,并为布氏杆菌标记疫苗的构建提供了一个新的候选基因。

关键词： virb12基因 virb12蛋白布氏杆菌标记疫苗布氏杆菌检测

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布鲁菌virb12基因的分泌表达及鉴定

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中国兽医杂志 2019年第4期55卷 31-34页

作者：张婷婷刘梦志冯生孙创业陈泽良刘宝山沈国顺沈阳农业大学畜牧兽医学院

为获得高纯度易纯化的布鲁菌virb12蛋白,根据GenBank中的virb12的基因序列设计引物并进行扩增,将其连接pBIC质粒后转化到短小芽孢杆菌中,得到了virb12蛋白的分泌型表达菌株。诱导后对其进行了PAGE和WesternBlot-ting鉴定。结果表明,成... 详细信息

为获得高纯度易纯化的布鲁菌virb12蛋白,根据GenBank中的virb12的基因序列设计引物并进行扩增,将其连接pBIC质粒后转化到短小芽孢杆菌中,得到了virb12蛋白的分泌型表达菌株。诱导后对其进行了PAGE和WesternBlot-ting鉴定。结果表明,成功构建了virb12的分泌表达菌株,诱导后在培养上清中大量表达,蛋白含量高达80%,其能与布鲁菌标准阳性血清、6×His单克隆抗体发生反应,与A19-Δvirb12菌株免疫血清不发生反应,有望用来作为抗原建立区分野毒感染血清和A19-Δvirb12免疫血清的检测方法,更好地进行布病的防控。

关键词：布鲁菌 virb12基因分泌表达

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牛种布鲁氏菌virb12基因的克隆、表达及纯化

牛种布鲁氏菌VirB12基因的克隆、表达及纯化

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中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第五次学术研讨会

作者：唐峰闫广谋唐雨顺刘永华李冰辽宁医学院畜牧兽医学院吉林大学动物医学学院

目的原核表达牛种布鲁氏菌Vir B12蛋白,并检测其免疫原性。方法提取细菌基因组DNA,根据Gen Bank中的Vir B12序列设计引物,利用PCR方法扩增出Vir B12基因,并克隆到p MD18-T simple载体上,测序,再亚克隆至p ET-30a（+）载体上,转化到大肠... 详细信息

目的原核表达牛种布鲁氏菌Vir B12蛋白,并检测其免疫原性。方法提取细菌基因组DNA,根据Gen Bank中的Vir B12序列设计引物,利用PCR方法扩增出Vir B12基因,并克隆到p MD18-T simple载体上,测序,再亚克隆至p ET-30a（+）载体上,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导,表达产物经组氨酸结合树脂柱纯化,并对纯化后的表达产物进行免疫印迹免疫印迹鉴定。结果重组质粒经Nde I与Sal I酶切后,可见5422和519 bp的片段,与预期值相符。转化至BL21（DE3）后,37℃诱导4 h,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表达出带有多聚组氨酸标签的融合蛋白Vir B12,纯化后的蛋白纯度达94%,经免疫印迹法分析,目的蛋白具有抗原特异性。结论成功表达了布鲁氏菌Vir B12蛋白,纯化蛋白具有抗原特异性。意义近年来,布病给人类健康和公共卫生安全带来严重问题。控制动物布病的发生对降低人类布病的发生具有重要意义。布鲁氏菌Vir B12基因能在感染布病的动物体内会产生Vir B12蛋白,该蛋白在胞内运输过程中发挥重要作用。本试验为进一步研究Vir B12蛋白的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。

关键词：牛种布鲁氏菌 virb12基因基因克隆蛋白纯化抗原特异性

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原核表达山羊布氏杆菌M5-90virb12蛋白及其在检测中的初步应用

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中国预防兽医学报 2011年第4期33卷 293-296页

作者：高宇哲胡森乔祖健刘林涛杨帆步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

为建立山羊布氏杆菌(Brucellar melitensis)血清学检测方法,本实验克隆了*** M5-90疫苗株的virb12基因,并表达了相应蛋白。经SDS-PAGE和western blot鉴定,重组virb12蛋白分质量约为25ku,具有较好的抗原性。以纯化的virb12重组蛋白为抗... 详细信息

为建立山羊布氏杆菌(Brucellar melitensis)血清学检测方法,本实验克隆了*** M5-90疫苗株的virb12基因,并表达了相应蛋白。经SDS-PAGE和western blot鉴定,重组virb12蛋白分质量约为25ku,具有较好的抗原性。以纯化的virb12重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,并检测90份***临床血清样品,检测结果与试剂盒及虎红平板凝集试验的检测结果符合率均为91.7%,结果表明,virb12重组蛋白作为包被抗原可用于***感染的血清检测,为进一步建立*** M5-90virb12缺失标记疫苗的鉴别检测提供方法。

关键词：山羊布氏杆菌 M5-90菌株 virb12基因原核表达间接ELISA

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牛种布鲁菌virb12蛋白的原核表达及纯化

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中国生物制品学杂志 2013年第8期26卷 1130-1133页

作者：唐峰闫广谋唐雨顺刘永华李冰辽宁医学院畜牧兽医学院辽宁锦州121001 吉林大学动物医学学院吉林长春130062

目的原核表达并纯化牛种布鲁菌(Brucella)virb12蛋白。方法利用PCR法从牛种布鲁菌基因组中扩增virb12基因,插入pET-30a(+)载体,构建重组表达质粒pETV12,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经组氨酸结合树脂柱纯化后... 详细信息

目的原核表达并纯化牛种布鲁菌(Brucella)virb12蛋白。方法利用PCR法从牛种布鲁菌基因组中扩增virb12基因,插入pET-30a(+)载体,构建重组表达质粒pETV12,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经组氨酸结合树脂柱纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果重组表达质粒pETV12经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约22 000,纯化的重组蛋白纯度达94%,可被布鲁菌免疫兔血清特异性识别。结论原核表达并纯化了牛种布鲁菌virb12蛋白,为进一步研究virb12蛋白的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。

关键词：布鲁菌 virb12基因原核细胞基因表达

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牛布鲁氏菌S19株virb12分子标记疫苗的构建及其功能分析

牛布鲁氏菌S19株VirB12分子标记疫苗的构建及其功能分析

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作者：王冲吉林大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种由布鲁氏菌引起的人兽共患的传染病，世界各地均有流行。疫苗预防接种是防治布鲁氏菌病的重要手段。牛用的主要疫苗是弱毒活疫苗S19，但是该型疫苗的保护力不高，安全性低，可引起人与动物发病，且不能用... 详细信息

布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种由布鲁氏菌引起的人兽共患的传染病，世界各地均有流行。疫苗预防接种是防治布鲁氏菌病的重要手段。牛用的主要疫苗是弱毒活疫苗S19，但是该型疫苗的保护力不高，安全性低，可引起人与动物发病，且不能用血清学方法区分感染动物是自然感染还是人工接种疫苗。如果广泛使用这种疫苗，将会给布鲁氏菌病的流行病学调查和对疫源地的防控带来困难，更严重的缺点是该型疫苗有可能返祖，存在散毒的潜在危险。基于以上原因，本研究的思路是运用同源重组技术，定向改造牛布鲁氏菌病疫苗S19的基因，改造疫苗功能，提高安全性，加以分子标记，使得血清学方法可以区分感染动物是自然感染还是接种S19改造疫苗。根据GeneBank中登录的牛布鲁氏菌S19的基因序列设计virb12基因的N端和C端同源臂序列的引物，以S19基因组为模板，扩增出virb12基因的N端和C端同源臂序列，同时扩增枯草杆菌中SacB基因序列，将各序列同pMD18-T连接，双酶切后同自杀性质粒pBK-CMV连接，构建pBK-virb12-N-C-SacB，转化S19感受态细胞，筛选出virb12基因缺失株S19Δvirb12。为研究缺失株S19Δvirb12的功能，通过感染巨噬细胞RAW264.7检测S19Δvirb12在巨噬细胞内的存活能力;以BALB/C小鼠为试验动物模型对S19Δvirb12进行毒力和安全性评价，用1×106CFU剂量的S19和S19Δvirb12接种小鼠，每组50只，同时设置对照组;用流式细胞仪分析小鼠外周血中CD4和CD8T淋巴细胞亚群，并用ELISA方法检测小鼠血清中的IL-2和IFN-γ，评价S19Δvirb12的免疫反应;在接种第六周，用1×105CFU剂量的***2308对小鼠进行攻毒试验，评价S19Δvirb12对小鼠的免疫保护力。根据牛布鲁氏菌S19的virb12基因序列设计引物，扩增virb12基因，连接pET28a构建重组表达载体pETvirb12，转化BL21感受态细胞，诱导表达目的蛋白，用组氨酸结合树脂柱纯化目的蛋白，Western blot分析目的蛋白的免疫原性，用纯化的virb12蛋白建立IELISA鉴别S19Δvirb12和S19接种的小鼠，并用virb12蛋白建立IELISA检测牛布鲁氏菌血清抗体。结果表明，构建的布鲁氏菌基因缺失株S19Δvirb12与亲本株S19相比，其毒力降低，免疫保护力相当，安全性提高;Western blot分析显示，virb12蛋白可与S19接种的小鼠血清反应，具有良好的免疫原性，与S19Δvirb12接种的小鼠血清不反应;IELISA方法可以区分S19Δvirb12和S19接种的小鼠血清，因此本研究所构建的基因缺失株S19Δvirb12具有毒力低、安全性高、可用血清学方法区分的潜在疫苗株。

关键词：牛布鲁氏菌病同源重组 virb12基因牛布鲁氏菌S19 检测方法

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