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药物生物技术 2024年第4期 331-337页

作者：潘成佳吉丽娜华子春南京大学生命科学学院医药生物技术全国重点实验室江苏省产业技术研究院医药生物技术研究所常州南京大学高新技术研究院南京吉芮康生物科技研究院

胶原蛋白是一个复杂而庞大的家族，人胶原蛋白肽链的相对分子质量高达45～344 kD,共有44个家族成员。为了揭示人胶原蛋白的进化机制，本研究构建了人胶原蛋白的进化树，分析了其氨基酸序列中结构域和保守基序(motif)的种类及分布特点。... 详细信息

胶原蛋白是一个复杂而庞大的家族，人胶原蛋白肽链的相对分子质量高达45～344 kD,共有44个家族成员。为了揭示人胶原蛋白的进化机制，本研究构建了人胶原蛋白的进化树，分析了其氨基酸序列中结构域和保守基序(motif)的种类及分布特点。结果发现人胶原蛋白具有14种结构域和10个motif,同一种结构域中往往包含相同的motif,进化树中同一分支上的胶原蛋白肽链也往往具有种类相同的结构域。在人胶原蛋白的非胶原结构域中，VWC结构域(von Willebrand factor type C domain)位于COL1A1、COL2A1、COL3A1和COL5A2中，这4种胶原蛋白位于人胶原蛋白全长序列进化树的同一分支上，但该分支中仅有COL1A2不包含VWC结构域。对不同物种COL1A2的N端序列进行多序列比对结果表明：COL1A2的VWC结构域在无脊椎动物向脊椎动物进化的过程中丢失。vwa结构域(von Willebrand factor type A domain)是胶原蛋白肽链中分布最广的非胶原结构域，存在于12种人胶原蛋白肽链中。vwa结构域蛋白质序列的BLAST比对结果表明，vwa结构域在人胶原蛋白的肽链之间复制。C4结构域(C-terminal tandem repeated domain intype 4 procollagen)只存在于IV型胶原蛋白中，对人胶原蛋白的C4结构域构建进化树，结果显示C4结构域中的C4-1和C4-2两个结构域进化速度一致，具有协同进化的现象。因此，胶原蛋白以结构域为基本进化单位，在进化中出现重复、缺失或协同进化的现象。

关键词：胶原蛋白进化分析结构域序列比对保守基序 vwa结构域 VWC结构域 C4结构域

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冰岛硫化叶菌FHA结构域蛋白SisFha及其互作蛋白Sisvwa1在DNA损伤应答中的功能研究

冰岛硫化叶菌FHA结构域蛋白SisFha及其互作蛋白SisvWA1在DNA损伤...

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作者：林子佳山东大学

学位级别：硕士

硫化叶菌(Sulfolobus)作为生活在高温和低pH下的极端古菌,其染色体DNA受到损伤的概率大,但其自发突变率与大肠杆菌相似,表明其具有高效的DNA修复系统。古菌中与信息处理有关的过程,包括DNA复制、修复、转录及蛋白质翻译等与真核生物相似... 详细信息

硫化叶菌(Sulfolobus)作为生活在高温和低pH下的极端古菌,其染色体DNA受到损伤的概率大,但其自发突变率与大肠杆菌相似,表明其具有高效的DNA修复系统。古菌中与信息处理有关的过程,包括DNA复制、修复、转录及蛋白质翻译等与真核生物相似,但这些过程中的蛋白组分比真核生物的简单。对硫化叶菌DNA损伤应答的研究可以作为真核生物DNA损伤应答研究的重要参考,也有利于对极端古菌抗逆机制的全面了解。含有FHA结构域的蛋白能够通过该结构域特异性地结合其他蛋白的磷酸化苏氨酸(pThr),从而在三域中发挥多种功能。在真核细胞中,许多参与DNA损伤应答的蛋白包含FHA结构域,并涉及磷酸化位点的结合及磷酸化信号传递。迄今为止,古菌中仅有两个含FHA结构域的蛋白被研究:东工大硫化叶菌Sulfolobus tokodaii的ST0829和嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius的ArnA,它们均与磷酸化介导的蛋白互作及鞭毛基因表达调控有关,其中ArnA在营养胁迫下调控鞭毛基因的表达。前期磷酸化蛋白组学数据显示,硫化叶菌的许多DNA损伤修复蛋白被磷酸化,说明磷酸化调控在硫化叶菌DNA损伤应答中十分重要。SisFha作为冰岛硫化叶菌中唯一包含FHA结构域的蛋白,可能参与磷酸化依赖的DNA损伤应答。本文主要围绕模式古菌冰岛硫化叶菌REY15A中SisFha蛋白在DNA损伤应答中的功能展开,以扩展FHA结构域在古菌中的功能认识,尤其是其在DNA损伤应答中的功能,加深对古菌乃至真核生物DNA损伤应答的认识。本研究取得了以下主要结果:(1)SisFha具有结合磷酸化位点的结构基础对三域中的FHA结构域进行序列保守性分析,FHA结构域的序列保守性低,但其结合pThr的位点保守性较高,这些位点在SisFha的FHA结构域中保守,表明SisFha具有结合磷酸化位点的结构基础。(2)SisFha蛋白参与DNA损伤应答,作为部分DNA损伤应答基因的负调控因子发挥作用使用多种DNA损伤剂处理Sisfha敲除菌株,其敏感性发生不同的变化。选择NQO作为损伤剂处理细胞,对其进行流式细胞术和细胞聚集度分析,结果显示相对于E233S菌株,Sisfha敲除菌株的死细胞比率减少,且细胞聚集程度增加,表明Sisfha的缺失提升了细胞对NQO的抵抗力。RT-qPCR及基于报告基因lacS的启动子活性分析显示,Sisfha的缺失有利于DNA损伤应答基因orc1-2、tfb3和ups基因的表达,尤其是ups。此外,SisFha的过表达菌株对NQO更加敏感,这与Sisfha敲除菌株表型相对应。(3)SisFha与多种功能的蛋白质相互作用对SisFha进行体内蛋白共纯化及蛋白质谱鉴定,发现SisFha的潜在互作蛋白种类很多,其中包括可能与细胞周期调控相关的蛋白激酶SiRe030、细胞分裂蛋白CdvA、与染色质稳定性相关的Sis7d(SiRe668)、保护DNA断裂以维持基因组完整性的反向旋转酶SiRe124及含介导蛋白互作结构域vwa的Sisvwa1和Sisvwa2等。通过pull down 实验进一步验证了 SisFha 与 SiRe030、Sis7d、Sisvwa1 和 Sisvwa2 的相互作用。(4)Sisvwa1与SisFha共同参与DNA损伤应答的调控构建Sisvwa1 和Sisvwa2 单敲菌株及Sisfha/Sisvwa1、Sisfha/Sisv WA2、Sisvwa2/Sisvwa1双敲菌株,使用NQO处理。ΔSisv WA1和ΔSisfha/Sisv WA1对NQO均有更强的抵抗力,与ΔSisfha的表型相同;而ΔSisvwa2表型与ΔSisfha不同。这表示Sisvwa1与SisFha在DNA损伤应答中共同作用。(5)Sisvwa1和SisFha对upsX启动子结合力更强利用电泳迁移率实验分析Sisvwa1和SisFha对DNA损伤应答中转录上调的orc1-2、tfb3、upsX基因启动子、转录下调的orc1-1启动子、无转录变化的SiRe719启动子的结合能力,结果表明Sisvwa1对这些启动子均有非特异性结合,而SisFha仅对upsX启动子有明显结合。另外,Sisvwa1与SisFha同时存在可以增强对upsX启动子的结合。综上,冰岛硫化叶菌SisFha蛋白参与调节细胞对DNA损伤的抵抗力,且这种调节可能需要Sisvwa1的协同作用,从而对DNA损伤应答基因(特别是ups)的启动子进行结合与调控。

关键词：冰岛硫化叶菌 FHA结构域 vwa结构域 DNA损伤应答蛋白磷酸化

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马氏珠母贝collagen Ⅵ(COLⅥ)基因的克隆和功能研究

马氏珠母贝collagen Ⅵ(COLⅥ)基因的克隆和功能研究

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作者：梁金连广东海洋大学

学位级别：硕士

Collagen Ⅵ(COLⅥ)是胶原蛋白家族的重要成员,广泛分布于动物体细胞外基质,在脊椎动物骨骼形成过程发挥重要作用。根据本课题组前期建立的马氏珠母贝贝壳基质蛋白数据库,筛选出六个在贝壳含量较高的COLⅥ蛋白。为了探究COLⅥ在马氏珠... 详细信息

Collagen Ⅵ(COLⅥ)是胶原蛋白家族的重要成员,广泛分布于动物体细胞外基质,在脊椎动物骨骼形成过程发挥重要作用。根据本课题组前期建立的马氏珠母贝贝壳基质蛋白数据库,筛选出六个在贝壳含量较高的COLⅥ蛋白。为了探究COLⅥ在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本实验运用聚合酶链式反应(PCR)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得COLⅥ基因的cDNA全长,利用荧光定量PCR技术检测基因的表达量分布,并采用原位杂交技术对COLⅥ进行精确定位。通过RNAi技术促使基因表达沉默,探究COLⅥ对贝壳结晶的影响。并利用原核表达技术获得了Pm COLⅥA4-1的重组蛋白。1.本实验成功克隆得到COLⅥ基因Pm COLⅥA4-1、Pm COLⅥA6-1、Pm COLⅥA6-2的cDNA全长。Pm COLⅥA4-1序列全长3136bp,其中开放阅读框(ORF)长2841bp,编码946个氨基酸,5’非翻译区(5’UTR)长93bp,3’非翻译区(3’UTR)长202bp。Pm COLⅥA6-1序列全长2100bp,其中开放阅读框(ORF)长1875bp,编码624个氨基酸,5’非翻译区(5’UTR)长56bp,3’非翻译区(3’UTR)长169 bp。Pm COLⅥA6-2序列全长2192bp,其中开放阅读框(ORF)长1941bp,编码646个氨基酸,5’非翻译区(5’UTR)长41 bp,3’非翻译区(3’UTR)长210bp。并验证了Pm COLⅥA3、Pm COLⅥA4-2、Pm COLⅥA5基因的编码区。通过序列分析发现六个COLⅥ均缺失Collagen结构域,而v WA结构域较为保守。2.珍珠囊和外套膜中央区及套膜区是分泌珍珠质的器官,本研究通过荧光定量PCR检测发现Pm COLⅥA3、Pm COLⅥA6-1和Pm COLⅥA6-2在珍珠囊的表达量最高(P结构,发现Pm COLⅥA3、Pm COLⅥA4-1、Pm COLⅥA4-2、Pm COLⅥA5、Pm COLⅥA6-1和Pm COLⅥA6-2基因表达沉默后,贝壳珍珠层内表面超微结构出现不同程度的紊乱,棱柱层结构正常,证明COLⅥ参与马氏珠母贝贝壳珍珠质的形成。4.本研究构建了p ET30a-Pm COLⅥA4-1的原核表达载体,成功地表达Pm COLⅥA4-1蛋白的v WA结构域区域。为了获得大量高纯度重组蛋白,本研究在IPTG浓度为0.5m M,诱导温度为15℃的条件下诱导过夜,对Pm COLⅥA4-1重组蛋白进行扩大培养,通过Ni-IDA亲和层析从包涵体中体中纯化得到3.5mg的Pm COLⅥA4-1融合蛋白。并通过Western blotting检测,鉴定重组蛋白的分子量在20k Da左右,与理论的分子量20.9k Da相一致。综上所述,Pm COLⅥA3、Pm COLⅥA4-1、Pm COLⅥA4-2、Pm COLⅥA5、Pm COLⅥA6-1和Pm COLⅥA6-2参与马氏珠母贝珍珠质的形成,本研究首次证明了COLⅥ参与软体动物贝壳的矿化,丰富了珍珠层基质蛋白数据库。

关键词： collagen Ⅵ vwa结构域外套膜珍珠层

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