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生殖与避孕 2006年第5期26卷 265-270页

作者：石建莉王旻程国艳胡燕琴刘春萌徐晨上海交通大学医学院组织胚胎学教研室上海市生殖医学重点实验室上海200025

目的:探索与人精子膜存在交叉反应的溶脲脲原体蛋白ureg抗体对小鼠体外受精的影响。方法:提取溶脲脲原体总DNA,用自行设计的引物扩增ureg全序列,PCR产物经TA克隆后,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,克隆到表达载体pET-28a(+)中。在***21中,异丙... 详细信息

目的:探索与人精子膜存在交叉反应的溶脲脲原体蛋白ureg抗体对小鼠体外受精的影响。方法:提取溶脲脲原体总DNA,用自行设计的引物扩增ureg全序列,PCR产物经TA克隆后,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,克隆到表达载体pET-28a(+)中。在***21中,异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达His融合蛋白。用亲和层析纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获取多克隆抗体。观察该抗体对小鼠体外受精的影响。结果:对表达重组蛋白的质粒进行DNA测序以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,证实获取了目的蛋白。ELISA检测证实,免疫小鼠产生了高效价的抗体。该抗体能够抑制小鼠精卵的融合。结论:与人精子膜存在交叉反应的溶脲脲原体蛋白ureg抗体,可导致小鼠精卵结合率降低。

关键词：溶脲脲原体 ureg 免疫不育多克隆抗体受精

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文昌鱼尿素酶辅助蛋白ureg基因的克隆、特性、进化分析和组织特异性表达的研究

文昌鱼尿素酶辅助蛋白UreG基因的克隆、特性、进化分析和组织特异...

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作者：薛积玉中国海洋大学

学位级别：硕士

在动物的进化历程中,文昌鱼是介于无脊椎动物与脊椎动物之间的过渡类型。利用分子生物学手段,研究文昌鱼有关基因的结构、进化和表达,不仅可为我们从分子水平上解开脊椎动物起源的奥秘,而且还可以从进化的角度进一步揭示有关基因的功能... 详细信息

在动物的进化历程中,文昌鱼是介于无脊椎动物与脊椎动物之间的过渡类型。利用分子生物学手段,研究文昌鱼有关基因的结构、进化和表达,不仅可为我们从分子水平上解开脊椎动物起源的奥秘,而且还可以从进化的角度进一步揭示有关基因的功能。尿素酶是存在于许多细菌、真核微生物、真菌、植物以及无脊椎动物中的蛋白分解酶,它可以将尿素分解为氨气和二氧化碳。研究认为尿素酶蛋白活性的发挥要依赖于尿素酶辅助蛋白的激活。尿素酶辅助蛋白基因编码的蛋白在金属镍离子聚合到酶活性位点上起重要作用。在四种主要的辅助蛋白UreD、UreE、UreF和ureg中,ureg的保守性最高,在整个尿素酶激活过程可能起到结合GTP,水解GTP的作用。迄今为止,尿素酶辅助蛋白ureg基因只在细菌、真菌和植物里有报道,在动物里尚未发现。我们在文昌鱼肠cDNA文库的大规模测序中,得到一个与尿素酶辅助蛋白ureg基因有高度相似性的克隆L239,(GenBank accession number: AAT39417)。它全长966 bp,含有一个603bp的开放阅读框(ORF),编码一个由200个氨基酸残基组成的蛋白,其推导的分子量为22.41 kDa,等电点为6.6。该基因包括一个5’起始密码子和3’的终止密码子;在78bp的3’非翻译区有一个多聚腺氨酸尾巴,在284bp的5’非翻译区还有一框内终止密码子和一个多聚嘌呤区域,表明该cDNA克隆具有完整的编码区。为了排除肠中微生物污染的可能性,我们又以文昌鱼肠以外的组织为模板对该基因进行了RT-PCR和巢式PCR分析,实验结果都呈阳性;以该克隆为探针进行的切片原位杂交试验显示在消化道外的组织中也有表达。这些都证明克隆L239确为文昌鱼本身的基因转录产物。有趣的是,对巢式PCR产物的内含子、外显子的结构和特殊的剪接位点的分析都表明克隆L239编码的是一个真核生物基因而不是转录中的假基因。将该基因编码的蛋白,通过NCBI上的BLASTP工具检索,发现该蛋白与尿素酶辅助蛋白ureg有很高的相似性。文昌鱼尿素酶辅助蛋白ureg的氨基酸序列与真菌、植物和细

关键词：文昌鱼 ureg 表达系统进化分析尿素酶

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武威市流行幽门螺杆菌尿素酶基因遗传多样性及Notch1、DLL4和HES1在胃癌中作用的探讨

武威市流行幽门螺杆菌尿素酶基因遗传多样性及Notch1、DLL4和HES1...

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作者：何黎黎兰州大学

学位级别：硕士

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染是引发上消化道疾病,包括胃癌的重要因素。尿素酶是Hp在胃内抵抗胃酸作用,赖以生存的关键因素,镍(Nickel, Ni)离子是尿素酶重要的金属激活剂。甘肃省武威地区为高Ni区且为国内胃癌高发区,长期的... 详细信息

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染是引发上消化道疾病,包括胃癌的重要因素。尿素酶是Hp在胃内抵抗胃酸作用,赖以生存的关键因素,镍(Nickel, Ni)离子是尿素酶重要的金属激活剂。甘肃省武威地区为高Ni区且为国内胃癌高发区,长期的高Ni环境对Hp尿素酶遗传特性的影响,值得深入探讨。Notchl、DLL4和HES1在胃癌发生发展中作用的研究,有助于为胃癌侵袭转移的预防和治疗提供新的理论基础。目的：1.分析武威地区流行Hp尿素酶相关基因ureA、ureB、ureE、ureF、ureg、 ureH和urel基因遗传多样性和进化特征;研究武威地区人血清中镍离子与Hp感染的关系,探讨Hp传播途径;分析武威地区Hp感染与疾病和生活习惯的关系,为探讨当地上消化道疾病高发原因,进一步研究Hp生物学特性、致病机制打下基础。2.检测Notchl, DLL4和HES1在胃癌、癌旁及淋巴转移组织中的表达,分析其表达与临床病理特征及其对患者生存和预后的影响,进一步探讨Notch信号通路在胃癌发生发展过程中的作用。方法：1.设计问卷对3996名受试者进行流行病学调查,通过14C呼气试验测定其Hp的感染状况,胃镜观察胃黏膜病变状况,取活检做病理检查,分析Hp感染与年龄、性别、胃黏膜病理类型和生活习惯的关系。2.采用微需氧培养技术,通过快速尿素酶试验结合培养特性和革兰染色后形态学观察,从目标人群胃黏膜中分离和鉴定Hp。3.设计Hp尿素酶相关基因ureA、ureB、ureE、ureF、ureg、ureH和urel引物,PCR扩增相关基因全序列,并对扩增产物进行测序。利用NCBI数据库及MEGA5.1软件分析武威地区Hp ureA、ureB、ureE、ureF、ureg、ureH和ureI基因的测序结果,构建遗传进化树进行相似性和进化距离分析,分析武威地区流行Hp尿素酶相关基因遗传进化分布与疾病的关系。4.收集受试者血清标本,采用原子吸收光谱法测定282名目标人群血清中镍离子浓度,分析探讨血清中镍离子与Hp感染的关系。5.收集14C呼气试验强阳性的患者家庭日常饮用水,选取Hp结构基因ureA, ureB引物进行PCR扩增,探讨Hp在当地的传播途径。6.选取胃癌患者术后石蜡标本(192例胃癌组织及56例癌旁组织),通过组织芯片和免疫组化技术,检测Notchl, DLL4和HES1在胃癌、癌旁及淋巴转移组织中的表达,分析其表达与临床病理特征间的关系,及其对患者生存和预后的影响,进一步探讨Notch信号通路在胃癌发生发展过程中的作用。结果：1.武威地区普通人群中Hp的阳性率为51.93%,其中Hp感染组消化道疾病发生率显著高于Hp未感染组(P=0.014)。Hp感染与是否经常食用腌渍和霉变食物显著相关(P=0.009;P=0.047)。2.从武威的凉州医院分离出的23株Hp,经过PCR扩增,成功获得Hp ureA全基因样本22份、ureB全基因样本18份、ureE全基因样本18份、ureF全基因样本21份、ureg全基因样本23份、ureH全基因样本15份和ureI全基因23份。所有样本均成功测序,获得了ureA、ureB、ureE、ureF、ureg、ureH和urel全基因序列信息。3.经过MEGA同源性分析发现,武威地区分离Hp的ureA基因进化更趋近于处在进化树右侧的F57、F32等亚洲菌株,矩阵分析得到的的平均进化距离为0.17729824;ureA基因在进化树中有地域聚集现象。ureB基因进化更趋近于处在其右侧的51、F57等亚洲菌株和shi169等南美菌株,矩阵分析得到平均进化距离为0.25467252;ureB在进化上有地域聚集现象。ureE基因进化更趋近于亚洲菌株51、F57、XZ274和南美菌株shi169、Puno135,矩阵分析的平均进化距离为0.03673317,在进化上有地域聚集现象。ureF基因进化更趋近于处在其右侧的F30、F57、XZ274等亚洲菌株,平均进化距离为0.03671494,在进化树中呈现地域聚集现象。ureg基因进化更趋近于亚洲菌株OK310、F30和欧洲菌株HPAG1、ELS37等,平均进化距离为0.03384030,在进化树中有地域聚集现象。ureH基因进化更趋近于亚洲菌株OK113、XZ274和欧洲菌株P12等,平均进化距离为0.05754463,进化树中有地域聚集现象。urel基因进化更趋近于处在其右侧的51、F30、OK310等亚洲菌株,平均进化距离为0.02708512,在进化树中呈地域聚集。4.武威地区Hp ureB基因与标准菌株间的进化距离(0.25467252)大于ureA基因的进化距离(0.17729824),ureA和ureB两个结构基因的进化距离大于辅助基因的进化距

关键词：武威幽门螺杆菌 ureA ureB ureE ureF ureg ureH urel 进化

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