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Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期的基因表达的调节

Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期的基因表达的调节

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作者：谢新民江苏大学

学位级别：硕士

目的:Hfq是细菌一种RNA分子伴侣,能够调节细菌很多基因尤其是毒力相关基因的表达,在伤寒沙门菌中,细菌在高渗应激条件下很多毒力相关基因表达改变。本研究的目的是探讨伤寒沙门菌Hfq调节因子在高渗应激条件下对基因表达的影响。方法:1.... 详细信息

目的:Hfq是细菌一种RNA分子伴侣,能够调节细菌很多基因尤其是毒力相关基因的表达,在伤寒沙门菌中,细菌在高渗应激条件下很多毒力相关基因表达改变。本研究的目的是探讨伤寒沙门菌Hfq调节因子在高渗应激条件下对基因表达的影响。方法:1.伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株制备。用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌hfq向基因缺陷变异株。根据伤寒沙门菌hfq基因序列设计引物,并在引物5'-末端加上需要的酶切位点,扩增hfq向基因上、下游同源性片段,定向连接成hfq基因缺损型同源核苷酸片段,并与自杀质粒pGMB151相连后,克隆至大肠埃希菌中,筛选阳性克隆,并对重组质粒进行测序鉴定,将阳性重质粒经电击法导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为hfq基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。2.全基因组芯片分析伤寒沙门菌转录表达谱。利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,体外模拟高渗环境应激,在低渗(50 mmol/LNaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株4h(37℃,250 rpm)至对数生长期,然后加入NaCl达到终浓度300 mmol/L(高渗),继续培养30 min后,分别提取野生株和hfq基因缺陷变异株的总RNA,反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后根据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异。3.在伤寒沙门菌hfq缺陷变异株中回补hfq基因。根据伤寒沙门菌hfq基因序列设计引物,用PCR扩增含启动子区域hfq基因,并将其与pBAD/gⅢ质粒定向连接,筛选重组质粒并进行测序鉴定,将阳性重组质粒经热击法导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株,作为hfq基因回补株,同时用pBAD空质粒导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株作为对照株。***-ompR双缺陷菌株变异株制备。将含hfq基因同源缺失片段的阳性重组自杀质粒pGMB151用电击法导入ompR缺陷菌株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为hfq-ompR双缺陷菌株。***-PCR分析基因表达。选择部分芯片分析显示表达差异基因,设计并合成特异性引物,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR),验证芯片分析结果;设计tvia基因特异性引物,qRT-PCR分析伤寒沙门菌野生型菌株、hfq基因缺陷变异菌株和hfq基因回补菌株分别在持续低渗、持续高渗和高渗应激环境中tvia的表达,以探查不同环境下hfq对tvia的调节作用;并进一步分析伤寒沙门菌野生型菌株、hfq基因缺陷变异菌株、ompR基因缺陷变异菌株和hfq-ompR双缺陷菌株在高渗应激下的tvia表达的变化,察看Hfq和OmpR对tvia的调节是否存在联系。结果:***及序列分析证实,hfq基因缺陷变异株中hfq基因缺失了132bp,表明成功构建hfq基因缺陷变异株。2.基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期有62个基因表达上调,有32个基因表达下调。这些基因主要涉及侵袭蛋白、外膜蛋白、代谢酶类和一些未知功能的推测蛋白。部分差异表达基因经qRT-PCR验证,结果显示与基因芯片表达谱分析结果一致。***及序列分析证实hfq基因回补菌株及hfq-ompR双缺陷菌株制备成功。4.在高渗应激下hfq基因缺陷变异株中tvia表达上调,hfq基因回补菌株tvia表达与野生株接近,而在持续低渗和高渗条件下野生株和hfq基因缺陷变异株中tvia的表达水平相似。在高渗应激下hfq-ompR双缺陷菌株中的tvia的表达水平与hfq基因缺陷变异株中的基本一致。结论:Hfq在伤寒沙门菌高渗应激条件下对基因表达调节及侵袭力的提高等发挥重要作用;伤寒沙门菌在高渗应激后Hfq能抑制tvia基因的表达,而在稳态高渗下没有作用;伤寒沙门菌Hfq在高渗应激下对tvia的调节与OmpR无直接相关。

关键词：伤寒沙门菌 hfq tvia 基因芯片高渗应激

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伤寒沙门菌Vi荚膜多糖影响巨噬细胞自噬作用的功能研究

伤寒沙门菌Vi荚膜多糖影响巨噬细胞自噬作用的功能研究

引用

作者：谢中艺江苏大学

学位级别：硕士

目的:伤寒沙门菌（Salmonella enterica serotype Typhi,***）Vi荚膜多糖是其独特的毒力因子。在伤寒沙门菌感染巨噬细胞过程中,自噬作用在宿主清除胞内菌中占有重要地位,但沙门菌也衍生出了抵御或利用自噬的策略。本课题组前期利用RNA-... 详细信息

目的:伤寒沙门菌（Salmonella enterica serotype Typhi,***）Vi荚膜多糖是其独特的毒力因子。在伤寒沙门菌感染巨噬细胞过程中,自噬作用在宿主清除胞内菌中占有重要地位,但沙门菌也衍生出了抵御或利用自噬的策略。本课题组前期利用RNA-seq技术分析***感染的巨噬细胞转录组,提示多个自噬相关基因发生差异表达。因此,本论文主要对***荚膜多糖与巨噬细胞自噬作用展开研究,以期阐明Vi荚膜多糖的表达特性,功能和作用机制。方法:***感染的巨噬细胞自噬水平分析分别获取***感染巨噬细胞各时相下的总RNA和总蛋白。用q RT-PCR检测自噬相关基因的m RNA水平;用western blot检测OPTN,p62,NDP52和LC3。***荚膜多糖的表达特性研究（1）胞外:分别获取***在SOB和LB液体培养基中静置培养2 h,8 h,12 h的总RNA,用q RT-PCR检测tvia,tvi B的m RNA水平。（2）胞内:q RT-PCR检测***感染巨噬细胞不同时间段下tvia,tvi B的m RNA水平;用流式细胞术和免疫荧光法检测不同感染时间段下巨噬细胞内Vi荚膜多糖的荧光强度。3.相关菌株构建（1）Δtvia和Δvex E:利用自杀质粒法和同源重组技术,分别制备***荚膜多糖编码基因tvia（调控作用）和vex E（运输作用）的缺陷变异株。（2）Δtvia-p BAD33-tvia（C-Δtvia）和Δvex E-p BAD33-vex E（C-Δvex E）:将tvia基因和vex E基因的编码区分别克隆至p BAD33表达质粒,电转化至Δtvia和Δvex E,制备Δtvia回补株（C-Δtvia）和Δvex E回补株（C-Δvex E）。同时向野生株WT,Δtvia和Δvex E中导入p BAD33空质粒作为对照菌株（分别为WT-p BAD33,Δtvia-p BAD33,Δvex E-p BAD33）。***荚膜多糖基因tvia,vex E的功能研究（1）生长曲线测定:绘制WT,Δtvia和Δvex E在SOB液体培养基中静置培养条件下的生长曲线,分析Vi荚膜多糖编码基因对细菌生长的影响。（2）巨噬细胞胞内生存试验:SOB静置培养并用L-阿拉伯糖诱导C-Δtvia,C-Δvex E,WT-p BAD33,Δtvia-p BAD33,Δvex E-p BAD33,将菌与巨噬细胞共培养后杀死胞外菌,并将各组细胞裂解物涂于LB平板计数菌落数T0。再分别将其余细胞继续培养2 h,12 h和24 h后裂解涂板并计数菌落。计算各菌株的T2/T0、T12/T0、T24/T0,以比较各菌株的胞内生存能力。（3）tvia,vex E对巨噬细胞自噬作用的影响:SOB静置培养并用L-阿拉伯糖诱导WT-p BAD33,Δtvia-p BAD33,C-Δtvia,Δvex E-p BAD33,C-Δvex E,收集以上菌株感染巨噬细胞的总蛋白,用western blot分析LC3和p62蛋白水平;WT,Δtvia,Δvex E感染巨噬细胞,用免疫荧光法检测后胞内的LC3点状聚集,用流式细胞术检测胞内LC3荧光强度,q RT-PCR检测Nod1,Nod2,Galectin8基因的m RNA水平。结果:***感染的巨噬细胞自噬水平分析（1）***感染巨噬细胞的转录组数据分析,提示在感染2 h或24 h,至少有21个与自噬途径相关基因的表达水平发生改变。q RT-PCR验证部分基因Rnf166,Atg4c,Atg16l1,Rubcnl,Lamp3,Casp1,Dapk1的m RNA水平变化与转录组基因的动态变化总体一致。（2）***感染与自噬作用的动态分析,表明与未感染组相比,感染30 min内,Rnf166,Atg4c,Atg16l1,Rubcnl,Lamp3,Casp1,Dapk1的m RNA水平均有上升趋势。感染6 h内,上调大部分Ndp52,p62,Optn,Galectin8,Lamp1,Rubcn,Lc3b的m RNA水平,但感染6 h的p62,Lc3b和Lamp1的m RNA略微下降;Western blot结果表明,感染2 h-6 h的OPTN,p62蛋白水平下降,LC3-II上升,感染12 h-24 h,OPTN及p62蛋白表达量明显上升,NDP52变化不显著,24 h的LC3-II含量达到最高。***荚膜多糖的表达特性研究（1）不同培养条件下的***荚膜多糖表达分析,表明SOB液体培养基中*** tvia和tvi B的m RNA水平

关键词：伤寒沙门菌巨噬细胞自噬 Vi荚膜多糖 tvia vexE

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