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tst基因在儿童金黄色葡萄球菌肺炎中的临床应用价值研究

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tst基因在儿童金黄色葡萄球菌肺炎中的临床应用价值研究

作者：褚敏君昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]检测金黄色葡萄球菌特有的毒力因子,中毒性休克综合征毒素-1的编码基因tst在儿童金黄色葡萄球菌肺炎（Staphylococcus aureus pneumonia,SAP）临床分离菌株中的携带情况,调查tst基因阳性菌株的耐药特征和分子特征,分析tst基因携... 详细信息

[目的]检测金黄色葡萄球菌特有的毒力因子,中毒性休克综合征毒素-1的编码基因tst在儿童金黄色葡萄球菌肺炎（Staphylococcus aureus pneumonia,SAP）临床分离菌株中的携带情况,调查tst基因阳性菌株的耐药特征和分子特征,分析tst基因携带情况与儿童SAP病情严重程度之间的相关性,进而对tst基因检测在儿童重症SAP中的实验诊断价值进行初步探讨。[方法]1.收集2018年11月-2020年12月昆明医科大学附属儿童医院SAP患儿临床分离得到的金黄色葡萄球菌共196株,使用实时荧光PCR法检测菌株mecA和tst基因的携带情况,采用VITEK2-Compact系统进行药物敏感性检测并进行耐药情况分析;对所有tst基因阳性菌株作agr分型和MLST分型,并针对tst基因阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）作SCCmec分型;进一步根据MLST结果进行tst基因阳性菌株的亲缘性分析。2.收集整理196株临床菌株所对应SAP患儿的临床症状、生命体征、实验室感染指标检查结果、肺部影像学检查结果以及肺外并发症情况等相关资料,逐一归纳、总结。按tst基因的携带情况将196例患儿分为tst+SAP组和tst-SAP组,分析tst基因携带与儿童SAP临床病情的相关性。3.根据诊疗指南将196例SAP患儿进一步分为重症SAP组和轻症SAP组,分析tst基因阳性菌株感染与儿童重症SAP之间的关联性及关联强度,绘制受试者工作特征（ROC）曲线,计算诊断效能指标评价tst基因检测对于儿童重症SAP诊断效能,并与现用的炎症检测指标WBC、N%、PCT、CRP进行比较。[结果]1.196株金黄色葡萄球菌中共检出tst基因阳性菌株24株,检出率为12.24%;mecA基因阳性菌株59株,被确认为MRSA,其余137株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（Methicillin-sensitive Staphylocccus aureus,MSSA）。59株MRSA中检出tst阳性3株（占5.08%）,137株MSSA中检出tst阳性21株（占15.33%）,差异有统计学意义（p＜0.05）。耐药分析结果显示,3株tst阳性MRSA均仅对青霉素耐药,21株tst阳性MSSA对青霉素、红霉素、克林霉素、四环素、左氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素以及复方新诺明的耐药率与tst阴性MSSA无显著差异（p＞0.05）。分子分型结果显示,24株tst阳性菌株的agr分型主要以agr1型为主（70.83%,17/24）,agr2型及agr3型各有3株（12.5%,3/24）,agr4 型有 1 株（4.17%,1/24）;MLST 分型分为 12 个 CC群,包含18个ST型,未发现明显优势型别。3株tst阳性MRSA的SCCmec分型均为Ⅳ型。用MLST构建系统发育树对tst阳性菌株进行亲缘分析,系统发育树分为两大分支,Group1和Group2,不同时间段,年龄,性别患儿的菌株在两支均有检出,无明显聚集现象。2.196例SAP患儿中共有tstSAP患儿24例,tst-SAP患儿172例。在临床症状表现上,tst+SAP患儿入院前发热人数占比大于tst-SAP患儿（p＜0.05）,热峰为39.17±0.77℃,高于tst-SAP患儿（p＜0.05）;而两者在入院前咳嗽人数、咳嗽天数和发热天数的差异均无统计学意义（p＞0.05）。在生命体征方面,tst+SAP患儿呼吸频率显著高于tst-SAP患儿,差异有统计学意义（p＜0.05）,体温、心率和血压差异无统计学意义（p＞0.05）。实验室感染指标的分析显示,tst+SAP患儿中性粒细胞百分比（N%）、CRP以及PCT水平均显著高于tst-SAP患儿,淋巴细胞百分比（L%）、Hb水平低于tsrSAP患儿,差异均有统计学意义（p＜0.05）,而WBC和PLT两个指标的差异无统计学意义（p＞0.05）。肺部影像学检查结果显示,tst+SAP患儿大片渗出灶检出率较高（41.67%）,而tst-SAP则主要以双肺纹理粗多,少许渗出为主（57.56%）,差异有统计学意义（p＜0.05）;并发症的发生情况为,tst+SAP患儿肺内并发症发生率高于tst-SAP患儿,差异有统计学意义（p＜0.05）,最常见的肺内并发症为胸腔积液;tst+SAP患儿肝功能受损以及发生肺外侵袭性感染的比例显著高于tst-SAP患儿（p＜0.05）。3.196例SAP患儿中共有轻症肺炎142例,重症肺炎54例。tst基因在重症肺炎组中检出率31.48%,轻症肺炎组中检出率为4.93%,轻重症肺炎间检出率差异有统计学意义（p＜0.05）,关联强度分析OR

关键词：金黄色葡萄球菌肺炎 tst基因

一种快速检测含tst基因的金黄色葡萄球菌的纳米生物传感器

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生物技术通报 2017年第12期33卷 81-86页

作者：李明阳贺气志马春霞俞建昆中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所中心实验室昆明650118 长沙医学院基础医学院应用生物学教研室长沙410219

基于荧光能量共振转移(Fluorescence energy resonance transfer,FRET)原理利用单壁碳纳米管(Single-walled carbon nanotubes,SWCNTs)构建一种操作简单、成本低、灵敏度高和选择性强的纳米生物传感器快速检测含有tst基因金黄色葡萄球... 详细信息

基于荧光能量共振转移(Fluorescence energy resonance transfer,FRET)原理利用单壁碳纳米管(Single-walled carbon nanotubes,SWCNTs)构建一种操作简单、成本低、灵敏度高和选择性强的纳米生物传感器快速检测含有tst基因金黄色葡萄球菌。将tst基因互补序列设计为探针,利用单壁碳纳米管联合羧基荧光素(FAM)标记的DNA分子探针(FAM-P)构建出FAM-P/SWCNTs复合检测体系。考察该体系对靶标序列和靶标菌的灵敏度和特异性。结果表明,该生物传感器对靶标序列的检测下限低至10 nmol/L,并在10-100 nmol/L范围内具有较好的线性关系(R2=0.994),对靶标菌的检测下限低至102,且在102-107CFU/m L范围内均呈现良好的线性关系(R2=0.999)。此外,在错配实验和对非靶标菌检测时,该传感器呈现了较高的特异性。本研究构建的FAM-P/SWCNTs体系能快速检测含tst基因金黄色葡萄球菌,并具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点,为食品检测、临床诊断等领域开辟了新途径。

关键词：单壁碳纳米管荧光标记的核酸探针 tst基因金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌tst基因差异表达及TSST-1致动脉粥样硬化作用研究

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金黄色葡萄球菌tst基因差异表达及TSST-1致动脉粥样硬化作用研究

作者：赵焕强上海交通大学

学位级别：硕士

金黄色葡萄球菌(金葡菌)是医院和社区感染常见的病原菌,所致感染与其产生各种毒素的能力相关。中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)是金葡菌产生的一种致热毒素,由中毒性休克综合征毒素基因(tst)编码,释放入血液可导致中毒性休克综合征(TSS)... 详细信息

金黄色葡萄球菌(金葡菌)是医院和社区感染常见的病原菌,所致感染与其产生各种毒素的能力相关。中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)是金葡菌产生的一种致热毒素,由中毒性休克综合征毒素基因(tst)编码,释放入血液可导致中毒性休克综合征(TSS),如未及时治疗死亡率可高达50%。本课题第一及第二部分旨在收集沪浙地区临床分离的金葡菌,调查tst基因的流行状况,检测不同菌株tst基因表达水平并观察是否存在差异;同时初步探讨菌株tst基因表达水平差异的分子机制。以期可以获得tst阳性菌株在沪浙地区的流行数据,了解该类菌株tst基因表达情况以及影响表达差异的可能机制,为临床监控该类菌株感染提供重要的理论依据。动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎性疾病,免疫反应在AS中发挥着重要作用。流行病学、临床病理学和动物模型研究均提示感染因子与动脉粥样硬化的发生发展有关。TSST-1为超抗原家族成员,极微量的该毒素即可引起大量T细胞活化、增殖并释放大量细胞因子,引起机体强烈的免疫应答。有研究表明,低浓度TSST-1慢性刺激可致兔全身性炎症反应进而促进Ⅱ型糖尿病(DM Ⅱ)的发展。那么这种慢性全身性炎症反应是否能加快兔AS斑块的形成呢?鉴于TSST-1在AS发生发展中的作用未有文献报道,在本课题第三部分,我们将含有TSST-1的AlZet胶囊渗透压泵植入新西兰大白兔皮下,模拟体内慢性炎症过程,观察TSST-1慢性释放6周后兔AS的形成情况,并初步探讨其可能的机制。本课题第三部分研究将有助于我们深入了解金葡菌与AS的关系,为AS提供有效的治疗和预防靶点。同时,对于研究人体正常定植菌群与疾病的关系也具有重要的启示作用。综上,本课题开展以下三部分研究,探讨金葡菌tst基因差异表达及其致动脉粥样硬化的作用。第一部分金黄色葡萄球菌tst基因流行情况及分子特征目的:了解tst基因在金葡菌中流行情况及tst基因阳性金葡菌的分子特征。方法:收集上海市及浙江省共7所医院的916株金葡菌,PCR检测tst、mecA和mecC基因.,并对tst基因阳性菌株做agr、SCCmec(针对MRSA)、PFGE、MLST及spa基因分型。结果:916株金葡菌中tst阳性208株,总阳性率22.7%;mecA基因阳性665株,未检测到mecC基因。在665株MRSA中,tst阳性198株(29.8%,198/665),agr和SCCmec分型均以2/Ⅱ型为主,分别占97.0%和94.4%;ST5为主要流行克隆,占68.8%(22/32);spa分型以t002为主,占82.3%(163/198);PFGE分型以E和F谱型所占菌株最多,分别占29.3%(61/208)和19.2%(40/208)。在251株MSSA中,tst阳性10株(4.0%),分子遗传学分型以ST5,t002,agr1及2为主:,且均分布于PFGEB(4株)及H(6株)谱型。结论:tst阳性 MRSA 以 ST5-agr2-t002-S CCmecⅡ 为主,占 39.3%(11/28),tst基因阳性率在MRSA中比在MSSA中高,临床应予以注意。第二部分tst基因转录水平表达检测及差异表达机制初步研究目的:了解临床分离金葡菌tst基因表达水平,并对其差异表达作初步机制探讨。方法:根据第一部分分子流行病学调查分析,挑选30株遗传背景差异较大的tst阳性金葡菌,qRT-PCR检测tst基因转录水平表达。随后挑选tst表达差异较大的菌株,从金葡菌中重要调节子(RNAⅢ、sigB、sarA、sarT、ccpA、srrA、srrB、rot和sarT)的转录表达水平,tst基因ORF及启动子序列分析等方面初步探讨差异表达机制。结果:挑选的30株tst基因阳性金葡菌中,22株(73.3%)tst mRNA相对表达水平介于3～5之间(以低表达菌株RJ24基因表达水平为1);表达水平最高的菌株(SJ0951)tst mRNA水平是表达最低菌株(RJ24)的8.4倍。我们挑选tst基因表达最高的H-LS1956、H-SJ0951及表达最低的L-RJ24、L-HK471作差异机制初步探讨。tst基因ORF及启动子区域测序并比对发现,四株差异表达菌株ORF序列完全一致,而两高表达菌株较低表达菌株在-114处出现一个碱基T的缺失。在RN4220菌株中验证上述启动子突变的意义,发现启动子碱基T缺失RN4220菌株tst基因mRNA表达水平是碱基T未缺失菌株的2.4倍。四差异表达菌株sigB、sarA、srrB和rot在转录水平表达差异不大;而srrA在菌株H-LS1956中,sarT在菌株L-RJ24中,RNAⅢ在菌株H-SJ0951中及ccpA在菌株L-HK471中表达水平较高。结论:临床分离的金葡菌tst基因表达存在差异,这种差异可能与tst

关键词：金黄色葡萄球菌 tst基因 MLST分型 agr分型 PFGE分型 SCCmec分型表达差异转录调控机制 TSST-1 动脉粥样硬化平滑肌细胞

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红肉火龙果tst基因家族的生物信息学分析

贵州农业科学 2020年第7期48卷 60-63页

作者：郑乾明王小柯马玉华贵州省农业科学院果树科学研究所贵州贵阳550006

为分离参与红肉火龙果果实可溶性糖积累的功能基因,基于转录组测序数据克隆液泡糖转运蛋白(Tonoplast sugar transporter,tst)基因家族,进行序列同源性、跨膜结构、亚细胞定位和系统发育等生物信息学分析。结果表明:红肉火龙果含有4个TS... 详细信息

为分离参与红肉火龙果果实可溶性糖积累的功能基因,基于转录组测序数据克隆液泡糖转运蛋白(Tonoplast sugar transporter,tst)基因家族,进行序列同源性、跨膜结构、亚细胞定位和系统发育等生物信息学分析。结果表明:红肉火龙果含有4个tst基因,开放读码框(open reading frame,ORF)长度为2127~2235 bp,编码长度为708~744个氨基酸的序列。预测等电点为4.84~5.36,相对分子量为75.7~80.4 kDa;红肉火龙果tst家族氨基酸序列与甜菜和藜麦tst家族具有74.9%~83.4%的相似性;红肉火龙果tst成员均含11~12个跨膜结构域,定位于质体、叶绿体、液泡或内质网等细胞器。系统进化分析表明Hptst1属于tst1类,Hptst2.1和Hptst2.2属于tst2类,Hptst3属于tst3类。

关键词：火龙果可溶性糖液泡亚细胞定位 tst基因

tst和pvl基因阳性金黄色葡萄球菌流行情况及分子特征

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中国感染与化疗杂志 2016年第3期16卷 353-358页

作者：赵焕强邹玉涵金姝舒文汤荣刘庆中上海交通大学附属第一人民医院检验科上海201620 上海市普陀区人民医院

目的了解中毒性休克综合征毒素-1的tst基因和杀白细胞素的pvl基因阳性金黄色葡萄球菌(金葡菌)流行情况及其附属基因调节子(agr)和葡萄球菌盒式染色体(SCCmec)型别。方法收集上海市及浙江省共7所医院的916株金葡菌,聚合酶链反应(PCR)检测... 详细信息

目的了解中毒性休克综合征毒素-1的tst基因和杀白细胞素的pvl基因阳性金黄色葡萄球菌(金葡菌)流行情况及其附属基因调节子(agr)和葡萄球菌盒式染色体(SCCmec)型别。方法收集上海市及浙江省共7所医院的916株金葡菌,聚合酶链反应(PCR)检测tst、pvl、mec A和mec C基因,并对tst或pvl基因阳性菌株作agr及SCCmec(针对甲氧西林耐药金葡菌,MRSA)遗传学分型。结果 916株金葡菌中tst阳性208株,阳性率22.7%;pvl阳性35株,阳性率3.8%;mec A阳性665株(MRSA),未检测到mec C基因。在665株MRSA中,tst阳性198株(29.8%),agr和SCCmec分型均以2/Ⅱ型为主,分别占97.0%和94.4%;pvl阳性14株(2.1%),agr分型以1型(85.7%)为主,SCCmec分型以Ⅲ型(42.9%)和Ⅳa型(28.6%)为主。在251株甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)中,tst阳性10株(4.0%);pvl阳性21株(8.4%)。tst阳性率在MRSA菌株中较MSSA中高,而pvl检出率则在MSSA菌株中较高,且浙江地区MRSA中pvl的阳性率高于上海菌株,差异均有统计学意义(Ptst基因在MRSA菌株中阳性率较MSSA高;pvl阳性率相对较低,但因其与某些严重的金葡菌感染相关,临床应予以关注。

关键词：金黄色葡萄球菌 tst基因 pvl基因 SCCmec分型 agr分型

费氏中华根瘤菌WGF03中tst和SiR基因的功能鉴定

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费氏中华根瘤菌WGF03中TsT和SiR基因的功能鉴定

作者：郭美树广西大学

学位级别：硕士

硫是所有生物体必需的化学元素之一。它与氮相互作用,不仅能够作为生物体大分子结构组分,而且还能在新陈代谢中发挥特定作用。近年来的研究表明根瘤菌结瘤因子中的还原性末端,其硫化修饰决定了根瘤菌的宿主专一性。硫代硫酸硫转移酶由Ts... 详细信息

硫是所有生物体必需的化学元素之一。它与氮相互作用,不仅能够作为生物体大分子结构组分,而且还能在新陈代谢中发挥特定作用。近年来的研究表明根瘤菌结瘤因子中的还原性末端,其硫化修饰决定了根瘤菌的宿主专一性。硫代硫酸硫转移酶由tst基因编码,通过NCBI网站的Blast比对,与Rhizobium ***234在核苷酸水平上有95%的一致性,在氨基酸水平上有98%的相似性。为了鉴定这个基因的功能,我们通过pK18mobsacB同源双交换的方式,构建tst基因的缺失突变体tstI。tst基因缺失突变后,在以硫代硫酸钠为唯一硫源的MM培养基中,突变菌株tstI不能生长,但是可以利用硫酸盐、亚硫酸盐、半胱氨酸和甲硫氨酸为唯一的硫源正常生长。植株实验发现,tst基因突变后,根瘤菌的结瘤时间推迟1天,竞争结瘤的能力下降,单株的结瘤数量也有所下降,同时在瘤重、植株干重和固氮酶活方面与野生型菌株*** WGF03存在显著差异。亚硫酸还原酶是硫代谢途径中的一个酶,催化亚硫酸盐还原为硫化物。该酶由SiR基因编码,通过NCBI网站的Blast比对,发现该序列与Rhizobium ***234在核苷酸水平上有96%的一致性,在氨基酸水平上有98%的相似性。为了鉴定这个基因的功能,我们通过pK18mobsacB同源双交换的方式,构建SiR基因的缺失突变体SiRI。SiR基因缺失突变后,在以硫酸钠、亚硫酸钠为唯一硫源的MM培养基中,突变菌株SiRI不能生长,而野生型菌株WGF03和互补菌株CSIRI生长正常,但是突变菌株SiRI可以利用硫代硫酸盐、半胱氨酸和甲硫氨酸为唯一的硫源的正常生长。植株实验也证实,SiR基因缺失突变后,根瘤菌的结瘤时间推迟2天,竞争结瘤的能力下降,单株的结瘤数量也有所下降,同时在瘤重、植株干重和固氮酶活方面与野生型菌株*** WGF03存在显著差异。

关键词：费氏中华根瘤菌 tst基因 SiR基因硫代谢植株实验

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金黄葡萄球菌中毒休克综合征毒素1的研究

中华微生物学和免疫学杂志 2008年第4期28卷 334-337页

作者：王敏李先平付炅范婧唐爱国中南大学湘雅二医院检验科湖南长沙410011 中南大学湘雅医学院医学检验系湖南长沙410011

目的应用PCR技术，检测金黄葡萄球菌的mecA基因和染色体上编码中毒休克综合征毒素1（TSST-1）的tst基因，了解tst基因的携带情况。方法用PCR法对我院2006年8月-2007年5月临床分离的84株金黄葡萄球菌mecA基因和tst基因进行体外扩增，建... 详细信息

目的应用PCR技术，检测金黄葡萄球菌的mecA基因和染色体上编码中毒休克综合征毒素1（TSST-1）的tst基因，了解tst基因的携带情况。方法用PCR法对我院2006年8月-2007年5月临床分离的84株金黄葡萄球菌mecA基因和tst基因进行体外扩增，建立快速、特异、灵敏的检测产TSST-1耐甲氧西林金黄葡萄球菌（MRSA）的方法。结果成功的对金黄葡萄球菌mecA基因和埘基因进行了检测，并进行基因测序。在我院84株受检金黄葡萄球菌中，41株金黄葡萄球菌的mecA基因扩增呈阳性，阳性株占48．81％。16株tst基因阳性，阳性株占19．05％。10株金黄葡萄球菌同时扩增出mecA基因和tst基因，阳性株占24．39％（10／41）。结论tst基因阳性株在临床分离的耐甲氧西林金黄葡萄球菌中占有较高的比例，应予以足够重视。

关键词：金黄葡萄球菌中毒体克综合征毒素1 mecA基因 tst基因

SYBR Green Ⅰ结合碳纳米管对金黄色葡萄球菌的快速检测

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南方农业学报 2013年第3期44卷 385-390页

作者：文晓棠毛平道邓乐铜仁职业技术学院贵州铜仁554300 湖南师范大学生命科学学院长沙410081

【目的】建立一种快速、准确检测金黄色葡萄球菌tst基因的方法,为预防和控制金黄色葡萄球菌感染提供检测手段。【方法】采用一段特异识别金黄色葡萄球菌的DNA探针来识别基因组DNA,通过识别荧光染料SYBRGreenI的信号来实现检测。通过对... 详细信息

【目的】建立一种快速、准确检测金黄色葡萄球菌tst基因的方法,为预防和控制金黄色葡萄球菌感染提供检测手段。【方法】采用一段特异识别金黄色葡萄球菌的DNA探针来识别基因组DNA,通过识别荧光染料SYBRGreenI的信号来实现检测。通过对此方法的可行性、单壁碳纳米管最适浓度、目标链最适浓度、特异性等进行验证,建立产TSST-1金黄色葡萄球菌tst基因的检测体系。【结果】在仅加入终浓度为1.07nmol/L目标DNA的条件下,荧光值的恢复率达91%,荧光值的增强值为4.764。最适碳纳米管浓度为30μg/mL,最适目标DNA浓度与探针DNA浓度相等,为1.07nmol/L。特异性检测结果表明,该检测方法可以区分具有高相似性的序列(2-或12-nt的区别)。【结论】SYBRGreenI结合碳纳米管适用于环境、食品及临床检验中对携带tst基因的金黄色葡萄球菌的快速检测。

关键词：金黄色葡萄球菌 tst基因 SYBR Green Ⅰ 单壁碳纳米管检测