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作者：李江梅山东农业大学

学位级别：硕士

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是重要外来入侵有害生物,给我国林业产业和生态环境造成重大威胁。高繁殖力是松材线虫重要致病因素,松材线虫雌雄比调节繁殖力。国内外对松材线虫病的研究,主要集中于病原、媒介昆虫、扩散机制、... 详细信息

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是重要外来入侵有害生物,给我国林业产业和生态环境造成重大威胁。高繁殖力是松材线虫重要致病因素,松材线虫雌雄比调节繁殖力。国内外对松材线虫病的研究,主要集中于病原、媒介昆虫、扩散机制、致病机理和防控措施等方面,在其发育生物学和繁殖生物学等方面的研究较少。性别作为生物长期进化过程中最重要的性状之一,它由性别决定和分化共同作用产生并维持控制,性别决定与性别分化影响个体的生殖能力和种群的性比,与物种的延续有关。tra-1基因是秀丽隐杆线虫性别决定中起重要作用的基因,是性别决定基因级联作用的终端全局调节因子。我们研究了松材线虫tra-1基因在性别决定中的作用,主要结果如下:(1)首次克隆了松材线虫tra-1基因,该序列总长度为2283 bp,编码760个氨基酸,该多肽含有5个连续的CH型锌指,属于五锌指蛋白,编码锌指转录因子tra-1A。其保守结构域、氨基酸序列、蛋白质三级结构域都与秀丽隐杆线虫的tra-1基因有较高的相似性,尤其是锌指结构域相似度更高。(2)选择松材线虫二龄幼虫进行tra-1基因RNAi,结果表明:松材线虫tra-1-a基因调控成虫的生殖结构的发育,两性生殖系统发育异常,主要表现为雌虫中卵巢、阴门等生殖系统结构畸形,雄虫精巢、交合刺产生畸形。同时发现,松材线虫tra-1基因经RNAi后,松材线虫雌雄比、繁殖力、雌虫繁殖率显著降低,并持续影响到子代。(3)鉴于tra-1本的基因功能特征,本研究对松材线虫发育特征研究有重要借鉴,为通过发育干扰防控松材线虫病提供了良好的基因资源。

关键词：松材线虫性别决定 tra-1 功能

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中华卵索线虫tra-1基因的克隆及表达分析

中华卵索线虫tra-1基因的克隆及表达分析

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作者：贺俊飞华中师范大学

学位级别：硕士

中华卵索线虫(Ovomermis sinensis)是一种昆虫病原线虫,其性别分化决定于寄生期的营养竞争压力(环境决定型),目前有关此类线虫性别决定及分化的分子机制还不清楚。为了探明中华卵索线虫性别决定及分化的机制,作者在参考国内外其它线虫... 详细信息

中华卵索线虫(Ovomermis sinensis)是一种昆虫病原线虫,其性别分化决定于寄生期的营养竞争压力(环境决定型),目前有关此类线虫性别决定及分化的分子机制还不清楚。为了探明中华卵索线虫性别决定及分化的机制,作者在参考国内外其它线虫等相关研究文献资料基础上,首次从该线虫中克隆到了性别决定基因tra-1 cDNA片段,并通过实时荧光定量PCR对其在中华卵索线虫发育各期中的表达情况进行了研究。主要的研究结果如下: (1)利用RT-PCR和3’RACE技术从中华卵索线虫中克隆了tra-1基因3’端cDNA部分序列。该序列总长度为800bp,编码一个包含195个氨基酸残基的多肽,用SMART软件对其蛋白质二级结构进行预测,结果显示该多肽含有3个连续的CH型锌指;同源性分析表明,本实验所获得的中华卵索线虫tra-1基因氨基酸序列与人的GLI3、果蝇CiD结构域、*** tra-1A、*** tra-1A及Ppa-tra-1在锌指结构区域具有较高的同源性,相似性分别为:70%、71%、73%、77%、71%,而在此区域外相似性仅为6%。从而说明中华卵索线虫tra-1基因编码的蛋白质亦属于GLI转录因子家族,且仅在锌指区域具有很高的保守性。 (2)通过实时荧光定量PCR检测了tra-1基因在中华卵索线虫胚胎、感染期幼虫、A组(感染比例为1:40)寄生1、2、3、4、5、6天幼线虫、B组(感染比例为1:10)寄生1、2、3、4、5、6天幼线虫、寄生后期雌幼线虫、寄生后期雄幼线虫、蜕皮后雌成虫、蜕皮后雄成虫和怀卵雌虫中的表达。结果显示,蜕皮后雌成虫tra-1相对表达量最高,且与其它时期的差异极其显著(P＜0.01);到怀卵雌虫与受精卵中tra-1相对表达量显著下降,但仍显著高于其它实验组(P＜0.05);其它实验组包括感染期幼虫、寄生各期幼虫(寄生1、2、3、4、5、6天)、寄生后期雌雄虫及雄成虫之间表达无明显差异(P＞0.05)。结合形态学研究结果比较分析表明,在性腺分化的关键时期,tra-1基因的高水平表达促使性腺分化为雌性生殖腺,低水平表达促使其分化为雄性生殖腺,即在中华卵索线虫,tra-1A参与调控生殖腺的发育与分化;由定量结果,我们还推测tra-1A参与调控该线虫卵的形成和胚胎发育。以上研究得出,tra-1A在中华卵索线虫中的功能与其在其它自由生活的线虫中的功能是一致的,从而说明tra-1A在功能上具有一定的保守性。通过以上对中华卵索线虫tra-1 cDNA序列及表达模式研究表明,tra-1基因在结构上及功能上具有很大的保守性,从而暗示了在寄生生活的线虫有可能存在与自由生活的线虫相似的性别决定与分化的信号级联通路,为进一步揭示营养决定分化机制打开一个突破口。

关键词：中华卵索线虫 tra-1 性别决定 RACE 实时荧光定量PCR

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