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副猪嗜血杆菌tfox基因介导自然转化功能的机制初探

副猪嗜血杆菌tfoX基因介导自然转化功能的机制初探

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作者：汤笑语四川农业大学

学位级别：硕士

自然转化(Natural transformation)作为细菌基因水平转移的主要方式之一,是指细菌主动摄取外源DNA,将其整合到自己的基因组上并稳定遗传的过程。副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)作为一种具有自然转化能力的细菌,这一特性已被... 详细信息

自然转化(Natural transformation)作为细菌基因水平转移的主要方式之一,是指细菌主动摄取外源DNA,将其整合到自己的基因组上并稳定遗传的过程。副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)作为一种具有自然转化能力的细菌,这一特性已被广泛用于构建基因缺失株和回补株,但对其自然转化的机制研究较少。本研究旨在了解GPS自然转化能力分布情况,并对tfox的分子差异及其介导自然转化机制进行初步探究。首先在实验室条件下对84株GPS野毒株和15株标准血清型菌株进行自然转化能力进行的鉴定,并将这些菌株的自然转化能力表型与血清型比对分析。结果显示44株菌株具有转化能力,55株菌株没有自然转化能力,并且所有划分为低毒力血清型菌株都具有自然转化能力,45%中等毒力血清型菌株具有自然转化能力,而只有29%的高毒力血清型菌株中具有自然转化能力。对NCBI上公布的副猪嗜血杆菌及其他四种细菌的自然转化的核心调控因子tfox序列进行同源性分析,发现副猪嗜血杆菌tfox可分为两种分子类型,而这种分子差异在其他细菌中不存在。进一步通过高分辨率熔解曲线技术和测序分析对本实验室99株副猪嗜血杆菌tfox序列进行分析,发现tfox在所有副猪嗜血杆菌中都存在两种分子类型:44株与具有高自然转化效率的GPS菌株SC1401一致;55株与不具有自然转化能力的GPS参考菌株SH0165一致。并且这两种分子类型可导致两种截然不同的自然转化表型:所有SC1401 tfox类型菌株都具有自然转化能力;所有SH0165 tfox类型菌株都不具有自然转化能力。构建重组打靶质粒pK18-tfox并通过自然转化转入SC1401构建tfox基因缺失株,制备tfox蛋白的多克隆抗体,通过Western Blotting鉴定缺失株是否构建成功。采用同样的方法将SC1401的tfox基因替换为SH0165的tfox基因。测定SC1401亲本株、tfox基因缺失株及SH0165 tfox基因替换株的自然转化频率,结果显示亲本株具有较高的自然转化频率,而缺失株和替换株自然转化能力丧失。采用荧光定量分别检测4株SH0165 tfox类型GPS野毒株和4株SC1401 tfox类型GPS野毒株的tfox转录水平,结果显示tfox的这种分子差异没有导致其转录呈现高、低两种水平。对SC1401亲本株和tfox基因缺失菌株进行比较转录组学和蛋白质组学分析,结果显示差异表达基因和蛋白较多富集在与碳源代谢相关的通路上。通过在SC1401生长环境中添加碳源再检测自然转化频率,发现菌株在丰富碳源环境下自然转化频率降低7倍左右,同时再在转化过程中添加不同浓度的cAMP,发现菌株自然转化频率逐步恢复。综上,本研究结果表明GPS不同菌株的自然转化能力存在较大差异,并且自然转化与血清型(毒力)之间存在关联性。tfox是GPS自然转化的核心调控因子,在GPS中tfox存在两种分子类型,其分子差异可以作为判断GPS是否具有自然转化能力的分子标记。tfox可能通过碳源的代谢来调节cAMP含量来调控自然转化功能。该研究结果可为全面明晰GPS自然转化的调控通路奠定基础。

关键词：副猪嗜血杆菌自然转化 tfox 分子差异转化频率

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cAMP受体蛋白CRP对霍乱弧菌和河弧菌自然感受态调控机制的研究

cAMP受体蛋白CRP对霍乱弧菌和河弧菌自然感受态调控机制的研究

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作者：吴睿中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

在自然条件下,细菌主动摄取外源DNA,通过同源重组整合入染色体稳定遗传的过程被称作自然转化（natural transformation）。自然转化是细菌中基因水平转移的重要策略之一。通过自然转化,细菌能够获得新的性状以适应外界不同的环境。大量... 详细信息

在自然条件下,细菌主动摄取外源DNA,通过同源重组整合入染色体稳定遗传的过程被称作自然转化（natural transformation）。自然转化是细菌中基因水平转移的重要策略之一。通过自然转化,细菌能够获得新的性状以适应外界不同的环境。大量的研究表明自然转化现象在弧菌科细菌中普遍存在,在弧菌的遗传多样性和进化中具有重要的作用。发生自然转化的前提条件是细菌须处于自然感受状态（natural competence）。 tfox（也称SXY）,是霍乱弧菌（V. cholerae）重要的感受态调节子,其编码基因是VC1153,在几丁质存在时,它可诱导感受态相关基因pilQ、pilA、comEA和ComEC的表达,对外源DNA的摄取和运输发挥着重要的作用。cAMP受体蛋白CRP （cAMP receptor protein, CRP）是细菌中重要的全局性调节子,对霍乱弧菌自然感受态形成也发挥重要的调节作用,能促进pilA、comEA和chiA-1的表达,但是具体机制仍不清楚。在本研究中,我们以霍乱弧菌和河弧菌（V.fluvialis）这两种重要的致病性弧菌为模式菌,进一步探索CRP对弧菌自然感受态的调控作用。基于文献中已确定的霍乱弧菌tfoxVC启动子区调控序列,我们通过软件Virtual Foot print和Regulatory Sequence Analysis Tools （RSAT）预测到其启动子区存在可能的CRP的结合位点。通过比较霍乱弧菌野生株和CRP缺失株遗传背景下mRNA水平、tfoxVC-lacZ启动子报告基因活性说明CRP转录水平调控感受态调节子tfoxVC,通过凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）进一步证明cAMP-CRP复合物直接结合于tfoxVC启动区调控tfoxVC的转录,进而促进细胞感受态的形成。自然转化表型实验表明,霍乱弧菌ACRP、Δtfox的转化频率都较野生株明显降低;与此相一致,与野生株相比ACRP、Δ1153、 ACRPΔ1153中感受态相关基因chiA-1、comEA、pilB、pilM mRNA的表达水平都呈下调趋势。为进一步证明cAMP-CRP复合物转录水平调节tfox的保守性,我们在新发食源性致病菌河弧菌中进行了验证。序列比对表明,河弧菌的tfoxVF与霍乱弧菌的tfoxVC在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为75.21%和80.69%。首先我们利用5’RACE （rapid-amplification of cDNA ends）确定了河弧菌tfoxVF mRNA的转录起始位点（transcription start site, TSS）位于tfoxVF ORF上游106bp处,据TSS推测的启动子-10区、-35区和SD序列分别为TATGAT、TCCGGA和GGGA。启动子区序列分析也表明存在可能的CRP结合位点。tfoxVF mRNA水平和tfoxVF -lux启动子报告基因活性检测及凝胶迁移实验证实同霍乱弧菌一样,河弧菌中cAMP-CRP复合体直接结合于tfoxVF启动区调控其转录。进一步的序列比对和生物信息分析表明这种调控机制在包括创伤弧菌、弗尼斯弧菌、鳗弧菌等在内的弧菌属中是保守的,其tfox同源基因上游都存在cAMP-CRP复合体的结合位点。此外,本研究初步探索了霍乱弧菌VC1152的功能,VC1152与tfoxVC编码基因VC1153的转录方向相反,共用染色体上的基因间隔区序列／启动子,存在CRP的结合位点。结构域分析表明VC1152含有HD-domain/PDEase-1, HD-domain是一保守的蛋白结构域,存在于具有磷酸水解酶活性的蛋白酶超家族中,这些蛋白可能参与细菌核酸代谢、信号转导或其他的功能调节等。本研究中我们探索了VC1152参与自然感受态的可能性和与CRP的调控关系。首先,我们利用5’ RACE确定了霍乱弧菌VC1152 mRNA的转录起始位点位于VC1152 ORF上游8bp处,启动子报告基因活性分析及VC1152转录水平分析表明CRP对VC1152有正向调节作用。自然转化实验中,霍乱弧菌△1152的转化频率比野生株明显降低。感受态相关基因转录水平分析显示,△1152中chiA-1、comEA、pilB、pilM mRNA的转录水平与野生株相比呈下调趋势。我们的结果初步提示VC1152可能参与霍乱弧菌自然感受态的形成,具体机制仍有待进一步研究验证。

关键词：霍乱弧菌河弧菌自然感受态 cAMP受体蛋白（CRP） tfox

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