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可溶性TGFβⅡ型受体（sTGFβRⅡ）与人γ干扰素融合蛋白的表达及生物学活性鉴定

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可溶性TGFβⅡ型受体（sTGFβRⅡ）与人γ干扰素融合蛋白的表达及...

作者：杨小华浙江大学

学位级别：硕士

肝纤维化是由于肝脏胶原等细胞外基质（Extra Cellular Matrix ECM）合成与降解失衡，导致在肝内过量沉积。研究表明活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell HSC）是肝纤维化过程中ECM的主要合成细胞;TGFβ1是已知最强的促纤维生成的... 详细信息

肝纤维化是由于肝脏胶原等细胞外基质（Extra Cellular Matrix ECM）合成与降解失衡，导致在肝内过量沉积。研究表明活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell HSC）是肝纤维化过程中ECM的主要合成细胞;TGFβ1是已知最强的促纤维生成的细胞因子，能促进HSC活化、增加ECM合成和沉积;因此，TGFβ／HSC轴成为抗肝纤维化治疗的一个重要靶点。sTGFβRⅡ和hIFN-γ都有抗肝纤维化作用，前者竞争性抑制TGFβRⅡ和TGFβ1的结合，从而阻断TGFβ1的生物学作用;后者通过Jak／Stat途经诱导Smad7表达、抑制TGFβ受体复合物与Smad3的相互作用，从而间接抑制TGFβ生物学活性、抑制HSC活化。sTGFβRⅡ和hIFN-γ能在不同位点阻断TGFβ1的生物学活性、抑制HSC活化，联合应用两者将可能产生抗肝纤维化的协同效应，并因减少了各自用量而降低副作用。实验目的构建可溶性人转化生长因子-βⅡ型受体（soluble transfouming growth factou beta receptou sTGFβRⅡ）与人γ干扰素（hIFN-γ）融合基因的真核表达质粒pSecTag2B—sTGFβRⅡ／hIFN-γ，并将pSecTag2B—sTGFβRⅡ／hIFN-γ在CHO S细胞进行表达;筛选高效表达细胞株并分析此融合蛋白的生物学活性和体外抗肝纤维化活性。为比较sTGFβRβ／hIFN-γ融合蛋白和sTGFβRⅡ蛋白的抗肝纤维化作用，构建了pSecTag2B—sTGFβRⅡ真核表达质粒，并在CHO细胞进行表达，分析其生物学活性。实验方法 1.通过两次亚克隆，将sTGFp班I基因和hIFN一Y基因融合构建到 pseeTagZB载体中，构建成psecT’a gZB一sTGFpR 11瓜IFN一Y真核表达质粒。将 psecl’a gZB一sTGFpRn爪IFN一Y体外转染CH0s细胞，筛选高效表达细胞株;收集培养上清液检测sTGFpRn和hIFN一Y水平，并分析所表达的融合蛋白的拮抗TGF困对Mvl Lu的增殖抑制活性、刺激NK细胞的活性、抗病毒活性;进一步检测融合蛋白体外对HSC活性的影响。 2.将sTGFpR 11基因插入pseeTagZB载体构建成pseeTagZB一 sTGFpRH，将其转染CHO细胞，收集培养上清液，检测sTGFpRn并分析其拮抗TGF田对Mvl Lu的增殖抑制活性。实验结果一pseeTagZB一sTGFpR 11爪IrN一Y进行酶切鉴定和测序分析结果与预期一致，说明成功构建了pseeTagZB一sTGr p R 11/h IFN一Y真核表达质粒。 2.分析pseeTagZB一sTGFpR 11小IFN一Y转染CHos后的蛋白表达。 ELISA检测显示（OD值450lun）重组质粒的表达上清中hIFN一Y为1 .97士0.29、 sToFpR 11为1 .77士0.11，显著高于空质粒对照（分别为015士0.05、0.23士0.05）（p<0.01）和空白对照（分别为0.09士0.01、0.19士0.10）(p

关键词： sTGFβRⅡ 融合蛋白抗肝纤维化生物学活性 Ⅱ型受体 stellate 肝星状细胞转染 γ干扰素 Smad

Involvement of the TAGE-RAGE system in non-alcoholic steatohepatitis: Novel treatment strategies

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World Journal of Hepatology 2014年第12期6卷 880-893页

作者： Masayoshi Takeuchi Jun-ichi Takino Akiko Sakasai-Sakai Takanobu Takata Tadashi Ueda Mikihiro Tsutsumi Hideyuki Hyogo Sho-ichi Yamagishi Department of Advanced Medicine Medical Research Institute Kanazawa Medical University Uchinadamachi Ishikawa 920-0293 Japan Laboratory of Biochemistry Faculty of Pharmaceutical Sciences Hiroshima International University Kure Hiroshima 737-0112 Japan Department of Hepatology Kanazawa Medical University Uchinada-machi Ishikawa 920-0293 Japan Department of Gastroenterology and Metabolism Hiroshima University Hospital Hiroshima 734-8551 Japan Department of Pathophysiology and Therapeutics of Diabetic Vascular Complications Kurume University School of Medicine Kurume Fukuoka 830-0011 Japan

Non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)is a major cause of liver disease around the *** includes a spectrum of conditions from simple steatosis to non-alcoholic steatohepatitis(NASH)and can lead to fibrosis,cirrhosis,liver failure,and/or hepatocellular *** is also associated with other medical conditions such as obesity,diabetes mellitus(DM),metabolic syn-drome,hypertension,insulin resistance,hyperlipidemia,and cardiovascular disease(CVD).In diabetes,chronic hyperglycemia contributes to the development of both macro-and microvascular conditions through a variety of metabolic ***,it can cause a variety of metabolic and hemodynamic conditions,including upregulated advanced glycation end-products(AGEs)*** our previous study,the most abundant type of toxic AGEs(TAGE);i.e.,glyceraldehyde-derived AGEs,were found to make a significant contribution to the pathogenesis of DM-induced ***,accumulating evidence suggests that the binding of TAGE with their receptor(RAGE)induces oxidative damage,promotes inflammation,and causes changes in intracellular signaling and the expression levels of certain genes in various cell populations including hepatocytes and hepatic stellate *** of these effects could facilitate the pathogenesis of hypertension,cancer,diabetic vascular complications,CVD,dementia,and ***,inhibiting TAGE synthesis,preventing TAGE from binding to RAGE,and downregulating RAGE expression and/or the expression of associated effector molecules all have potential as therapeutic strategies against ***,we examine the contributions of RAGE and TAGE to various conditions and novel treatments that target them in order to prevent the development and/or progression of NASH.

关键词： alcoholic NASH glycation AGEs fructose pathogenesis inhibiting stellate microvascular obesity

大鼠TGFβⅡ型受体胞外区与IFNγ融合表达及其抗肝纤维化研究

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大鼠TGFβⅡ型受体胞外区与IFNγ融合表达及其抗肝纤维化研究

作者：郁子扬浙江大学

学位级别：硕士

肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程，其主要的病理特征为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝Disse间隙的过度沉积。活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝纤维化发生... 详细信息

肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程，其主要的病理特征为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝Disse间隙的过度沉积。活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝纤维化发生时主要的ECM合成细胞，其活化过程主要由转化生长因子(TGF)β介导，后者是最强的促HSC活化因子。因而TGFβ／HSC轴作为潜在的抗肝纤维化治疗靶点，受到众多研究者重视。TGFβ发挥生物学作用须与细胞表面TGFβ受体(TβR)结合。而缺陷型TGFβⅡ型受体(dominant-negative TβR)、可溶性TβRⅡ(soluble TGFβRⅡ，sTβRⅡ)共同点是均可结合TGFβ而不能启动信号转导。另有研究表明，IFNγ在体外及体内实验中均抑制HSC活化，减轻动物肝纤维化程度其机制为通过JAK／STAT途径抑制TGFβ信号转导，从而拮抗后者的致纤维化作用，因而sTβRⅡ和IFNγ在抗肝纤维化中具有潜在的协同作用。细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物，其生物学活性较各单体大大增强。为探讨sTβRⅡ和IFNγ在抗肝纤维化中潜在的协同作用及融合表达对细胞因子活性的增强作用，本研究在国内外首次构建了稳定表达大鼠sTβRⅡ-IFNγ(sTβRⅡ-IFNγ)融合蛋白的真核表达系统。通过体外抗HSC活化实验和体内抗肝纤维化基因治疗实验证明sTβRⅡ和IFNγ融合表达可使两者发挥联合作用，为新型抗肝纤维化药物研究奠定了基础。Part 1.大鼠sT胆n一IFN丫融合蛋白真核表达及体外杭HsC活化研究从大鼠肝脏提取mRNA，分别采用相应引物RT-PCR扩增得到sTp斑I和IFN丫基因片段，先将IFN丫基因定向克隆至pseeTagZ表达载体，经amp抗性筛选、酶切鉴定、测序鉴定后，转染CHo细胞检测目的蛋白IFN丫的正确表达。再将sTpRll基因以常规方法定向克隆至psecT’ag2/I FN丫重组体，经田，p抗性筛选、双酶切及测序鉴定后，得到 psecl’a gZ/sTp犯卜IFN丫真核表达质粒，并以脂质体包裹转染cHO细胞，经zeodn抗性筛选得到高效稳定表达sTp班I一正脚的细胞株。分别采用W比tem B10tting和ELISA方法检测转染后CHO培养上清，.证实其中含有可同时与sTpRll抗体和IFN丫抗体发生特异性反应的目的蛋白，分子量约为43kDa。为检验该融合蛋白sTp班I部分和IFNY部分的生物学活性，分别采用抗TGFp增殖抑制实验和抗病毒活性实验。在实验中，TGFp对MvlLu增殖抑制作用可被sTpRH一IFNY融合蛋白拮抗，且具有浓度依赖关系，证明sTpRll一IFN丫融合蛋白具有sTpRH的生物学活性:在抗病毒活性实验中，无sTpRI 1.开N丫保护的L929细胞在一定浓度的vSV攻击下在24小时内即出现典型的病毒感染迹象，而经sTpRH·IFNY融合蛋白预先处理的L929细胞抵御VSv攻击的能力大为增强，且sTpR工卜IFN下保护力与其浓度有依赖关系。说明sTp犯I一IFN丫具有大鼠IFNY抗病毒活性。在进一步的体外抗肝纤维化实验中，用sTpRll一I刚丫预处理HsC，然后以TGFpl诱导其活化，72小时后以Wrestem Blotting法检测其a一SMA和Coll、111表达。结果表明，sTpRH·IFNY预处理的Hsc对TGF印的反应性发生显著改变:表现为a一sMA和coll、m表达较单独TGF印处理组HsC显著减少，表明该融合蛋白在体外实验中可抑制Hsc活化及EcM表达，且该作用较单体sTpRH或IFN丫更强，因此sTpRH一IFN丫融合蛋白可能具有潜在的肝纤维化协同作用。结论:1.本研究成功构建了表达大鼠sTp即I一IFN丫融合蛋白的真核表达质粒 psecTagZ/sTpRll一IFNY，并在真核细胞

关键词：抗肝纤维化 IFNγ TGFβ 大鼠 Ⅱ型受体融合蛋白纤维化程度细胞因子 stellate 肝星状细胞

Antifibrotic effects of ambrisentan,an endothelin-A receptor antagonist,in a non-alcoholic steatohepatitis mouse model

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World Journal of Hepatology 2016年第22期8卷 933-941页

作者： Toshiaki Okamoto Masahiko Koda Kennichi Miyoshi Takumi Onoyama Manabu Kishina Tomomitsu Matono Takaaki Sugihara Keiko Hosho Junichi Okano Hajime Isomoto Yoshikazu Murawaki Division of Medicine and Clinical Science Department of Multidisciplinary Internal Medicine Tottori Univer-sity Second Department of Internal Medicine Tottori University

AIM: To examine the effects of the endothelin type A receptor antagonist ambrisentan on hepatic steatosis and fibrosis in a steatohepatitis mouse ***: Fatty liver shionogi(FLS) FLS-ob/ob mice(male, 12 wk old) received ambrisentan(2.5 mg/kg orally per day; n = 8) or water as a control(n = 5) for 4 wk. Factors were compared between the two groups, including steatosis, fibrosis, inflammation, and endothelin-related gene expression in the ***: In the ambrisentan group, hepatic hydroxyproline content was significantly lower than in the control group(18.0 μg/g ± 6.1 μg/g vs 33.9 μg/g ± 13.5 μg/g liver, respectively, P = 0.014). Hepatic fibrosis estimated by Sirius red staining and areas positive for α-smooth muscle actin, indicative of activated hepatic stellate cells, were also significantly lower in the ambrisentan group(0.46% ± 0.18% vs 1.11% ± 0.28%, respectively, P = 0.0003; and 0.12% ± 0.08% vs 0.25% ± 0.11%, respectively, P = 0.047). Moreover, hepatic RNA expression levels of procollagen-1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1) were significantly lower by 60% and 45%, respectively, in the ambrisentan group. Inflammation, steatosis, and endothelin-related m RNA expression in the liver were not significantly different between the ***: Ambrisentan attenuated the progression of hepatic fibrosis by inhibiting hepatic stellate cell activation and reducing procollagen-1 and TIMP-1 gene expression. Ambrisentan did not affect inflammation or steatosis.

关键词： Endothelin Ambrisentan Steatohepatitis Hepatic stellate cell Hepatic fibrosis Oxidative stress Hepat

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肝纤维化的发病机制及抗纤维化研究进展

中西医结合肝病杂志 2001年第S1期11卷 35-38页

作者：王小众福建医科大学附属协和医院福州350000

近10年来由于分子生物学技术的应用,肝纤维化的临床与实验研究取得了长足的进步,使得人们对肝纤维化有了一些新的认识,主要研究进展包括以下几方面。 1 肝星状细胞的激活与转化是纤维化形成的关键肝实质细胞(hepatocyte)是肝脏主要的... 详细信息

近10年来由于分子生物学技术的应用,肝纤维化的临床与实验研究取得了长足的进步,使得人们对肝纤维化有了一些新的认识,主要研究进展包括以下几方面。 1 肝星状细胞的激活与转化是纤维化形成的关键肝实质细胞(hepatocyte)是肝脏主要的细胞成分,行使着代谢、贮存与解毒等重要功能。除肝实质细胞外,枯否细胞(kupffer cell)、星状细胞(stellate cell,HSC)

关键词：肝纤维化星状细胞枯否细胞肝细胞损害 stellate hepatocyte 发病机制肝实质细胞细胞外基质细胞因子

肝脏再生是受复杂有序信号调控的结果——从发现肝星状细胞可促进肝脏再生谈起

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肝脏 2016年第4期21卷 311-312页

作者：于乐成解放军第八一医院全军肝病中心南京210002

2014年12月Kordes等[1]在《临床研究杂志》上发表了题为《肝星状细胞促进祖细胞和肝脏再生》的研究报告。他们采用维甲酸依赖性荧光激活性细胞分类法,从能够表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的大鼠中分离和纯化这些... 详细信息

2014年12月Kordes等[1]在《临床研究杂志》上发表了题为《肝星状细胞促进祖细胞和肝脏再生》的研究报告。他们采用维甲酸依赖性荧光激活性细胞分类法,从能够表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的大鼠中分离和纯化这些维甲酸存储性（hepatic stellate cells,HSCs）,然后将GFP＋HSCs移植至野生型（wild-type,WT）大鼠肝损伤模型中。

关键词：肝星状细胞肝脏再生祖细胞鼠肝损伤模型 stellate 野生型大鼠肝损伤维甲酸细胞群

A Study of Lectin Affinity Differences Between Sensory Neurons and Autonomic Neurons

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解剖学报 1988年第4期 364-364页

作者： Cai Ligang Zhang Huzeng Wang Jianben Department of Anatomy Tongji Medical UniversityWuhan

It has been reported that the different kinds of lectins selectively combined witch various types of neurons in spinal ganglia and that thiamine monophosphatase(TMPase)are characteristic enzymes of medium and small size neurons in the spinal ganglia,but so far,no observations and comparisons have been made in ganglia of different natures.

关键词： ganglia labeled affinity Lectin sensory witch enzymes stellate probing stained

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PANCREAS

China Medical Abstracts(Internal Medicine) 2003年第4期20卷 218-218页

10.1 Pancreatitis2003452 Roles of pancreatic stellate cells in the pathogenesis of pancreatic fibrosis in rats. WANG Xingpeng(王兴鹏), et al. Dept Gastroenterol, Shanghai 1st People’ s Hosp, Shanghai Jiaotong Univ, S... 详细信息

关键词： stellate pathogenesis TNBS swelling collagen PANCREAS Angiotensin gradual antagonist removed

Potential role of NADPH oxidase in pathogenesis of pancreatitis

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World Journal of Gastrointestinal Pathophysiology 2014年第3期5卷 169-177页

作者： Wei-Li Cao Xiao-Hui Xiang Kai Chen Wei Xu Shi-Hai Xia Department of Hepatopancreatobiliary and Splenic Medicine Affiliated Hospital Logistics University of the Chinese People’s Armed Police Forces

Studies have demonstrated that reactive oxygen species(ROS) are closely related to inflammatory disorders. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase(NOX), originally found in phagocytes, is the main source of ROS in nonphagocytic cells. Besides directly producing the detrimental highly reactive ROS to act on biomolecules(lipids, proteins, and nucleic acids), NOX can also activate multiple signal transduction pathways, which regulate cell growth, proliferation, differentiation and apoptosis by producing ROS. Recently, research on pancreatic NOX is no longer limited to inflammatory cells, but extends to the aspect of pancreatic acinar cells and pancreatic stellate cells, which are considered to be potentially associated with pancreatitis. In this review, we summarize the literature on NOX protein structure, activation, function and its role in the pathogenesis of pancreatitis.

关键词： Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase Reactive oxygen species Pancreatitis Pancreatic acinar cells Pancreatic stellate cells