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spot基因在幽门螺杆菌定植过程中的功能研究

spoT基因在幽门螺杆菌定植过程中的功能研究

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作者：丁健山东大学

学位级别：硕士

目的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H pylori）是一个重要的人类病原菌,革兰染色阴性、螺杆状、微需氧菌,特异性寄生于胃粘膜,其感染可导致慢性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤及胃癌的发生,1994年世界... 详细信息

目的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H pylori）是一个重要的人类病原菌,革兰染色阴性、螺杆状、微需氧菌,特异性寄生于胃粘膜,其感染可导致慢性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤及胃癌的发生,1994年世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）已将其列为Ⅰ类致癌因子。现在世界人口中大约一半被H pylori感染,中国是感染的高发区,并且在不接受抗菌治疗的情况下被感染者一般终生带菌。尽管如此,迄今为止Hpylori的传播途径和持续性感染机制还不明确,由此制约了针对Hpylori感染的预防和治疗。 H pylori在定植于宿主胃粘膜细胞的过程中可诱发强烈的炎症反应,这一过程刺激宿主免疫细胞产生大量的活性氧分子（ROS）和活性氮中介物（RNI）。虽然受到大量ROS／RNI的氧化刺激,H pylori却能够成功地在胃粘膜定植并生存。这说明H pylori具有有效的适应氧应激系统。研究发现H pylori具有较多抗氧应激的效应基因,但调控基因却较少,因此H pylori抗氧应激调控机制尚不明确。研究表明宿主通过细胞免疫防御幽门螺杆菌感染,特别是巨噬细胞的吞噬作用,然而幽门螺杆菌可以有效的应对细胞免疫特别是Th1细胞免疫应答,其中vacA与尿素酶基因在其免疫逃逸中具有重要作用。然而,幽门螺杆菌免疫逃逸调控机制却研究甚少。 spot基因是一个全局性的转录后调控基因,其功能最早发现是调控大肠杆菌的严谨应答。所谓严谨应答是指细菌为了应对氨基酸饥饿而发生的基因表达模式的剧烈变化也称作“营养应激应答”。现在将细菌在各种不利生存环境下发生的基因表达模式的改变统称为“严谨应答”。在H pylori基因组中也含有这个基因,最近研究发现在恶劣环境下,spot基因也可以调控H pylori的严谨应答,但机制未明。Hpylori在宿主体内定植过程中受到的氧应激与吞噬可以看做一种严谨环境,因此我们的研究主要探讨spot基因在H pylori在宿主体长期定植适应宿主免疫应答过程中所起的作用,并对观察到的现象作出初步解释,为Hpylori的预防和治疗提供线索。方法 1、将已构建好的H pylori spot基因缺失突变株和野生株分别多次经口感染蒙古沙鼠,分别于末次感染后的第2、4、6、8周脱颈处死蒙古沙鼠,取其胃粘膜组织进行分离培养和革兰染色初步鉴定细菌,应用实时荧光定量PCR绝对定量方法对H pylori进行鉴定和数量测定。 2、用人外周血中免疫细胞分别刺激H pylori spot基因缺失突变株和野生株,并取两个作用时间点：30分钟和60分钟。提取标本RNA,反转录后应用实时荧光定量PCR分别测定比较它们抗氧应激相关基因（sodB、katA、tasA、rocF）、毒力基因（cagA、vacA、napA）、降解受损蛋白相关基因（clpP、clpX）在mRNA水平的表达情况。 3、动物实验中处死蒙古沙鼠时同时摘眼球取血,收集每次每组血清保存于-80℃,酶联免疫吸附测定方法测定并比较外周血液中的DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的含量,以此反应不同菌株在体内产生活性氧的水平,间接反应不同菌株感染诱导产生免疫细胞的水平。 4、用超氧化物阴离子荧光检测探针DHE装载人外周血的免疫细胞,Hpylori spot基因缺失突变株和野生株分别作用于一定量的人外周血的免疫细胞不同时间后,用流式细胞术测定比较不同菌株在体外产生活性氧水平。结果 1、动物实验表明H pylori spot基因缺失突变株和野生株均可在蒙古沙鼠胃内成功定植;H pylori spot基因缺失突变株在蒙古沙鼠胃粘膜的定植能力明显低于野生株,在第8周时甚至几乎检测不到突变株定植。 2、spot基因缺失突变株中大部分抗氧应激基因（sodB、katA、tasA、rocF）、毒力基因（cagA、vacA、napA）在mRNA水平表达异常,两个与降解受损蛋白相关的关键基因（clpP、clpX）表达降低。 3、蒙古沙鼠感染H pylori野生菌株组（W组）与感染突变菌株组（M组）比较,末次感染后第2、4、6周蒙古沙鼠外周血中8-OHdG含量两组相差不大,但第8周M组明显少于W组。 4、在各个时间点进行比较发现：H pylori野生菌株作用组均比spot基因缺失突变菌株作用组产生活性氧多。结论 H pylori spot基因缺失突变株与野生株比较在宿主体内定植力下降。但spot突变株中与抗氧应激力和生存力相关的大部分基因转录水平却是上调的,毒力因子表达水平的改变及降解损伤蛋白基因的下降揭示了突变株在胃内定植力

关键词： spot基因幽门螺杆菌氧应激严谨应答

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植物青枯菌spot与relA基因功能研究

植物青枯菌spoT与relA基因功能研究

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作者：梁欢中国农业科学院

学位级别：硕士

由雷尔氏菌属致病种(Ralstonia spp.)引起的植物细菌性枯萎病(bacterial wilt of plants俗称“青枯病”)是世界性重大土传病害。青枯菌通过内部调节机制适应复杂多变的自然环境,其中鸟苷四磷酸(即,ppGpp)是一种警示性信号分子,当细菌处... 详细信息

由雷尔氏菌属致病种(Ralstonia spp.)引起的植物细菌性枯萎病(bacterial wilt of plants俗称“青枯病”)是世界性重大土传病害。青枯菌通过内部调节机制适应复杂多变的自然环境,其中鸟苷四磷酸(即,ppGpp)是一种警示性信号分子,当细菌处于逆境条件时,细胞内ppGpp的水平发生变化,进而调控细菌细胞的运动性、生物膜形成等生物学功能,调控细菌更好的适应逆境条件,relA是负责合成ppGpp的基因,spo T是负责合成降解ppGpp的双功能基因。本研究以青枯菌4号生理小种Z-Aq-1菌株为研究对象,通过反向遗传学的手段构建relA和spot基因缺失菌株及其相应互补菌株,解析青枯菌relA和spot基因与致病性、运动性和生物膜形成等生物学表型之间的关系。富营养培养基为青枯菌分离培养常用培养基,寡营养培养基更贴近于青枯菌在寄主植物中的生长环境,为此,应用转录组测序技术,测定在富营养和寡营养两种培养条件下Z-Aq-1菌株与relA、spot基因突变菌株之间的转录本差异,发掘突变菌株和野生型菌株差异表达基因,以期探明relA、spot基因的功能并发掘与运动性相关基因,为进一步明晰青枯菌在逆境条件下的调控机制奠定理论基础。*** Gpp相关基因relA和spot基因功能验证致病性测定结果表明,Z-Aq-1△relA和Z-Aq-1△spot菌株的致病能力较野生型菌株均无显著差异。生长曲线测定结果表明,NB培养基中,突变菌株和野生型菌株生长速率无显著差异,而hrp培养基中,与野生型菌株相比relA、spot突变菌株在对数期的生长速率均显著上升,且spo T突变菌株快于relA突变菌株。生物膜测定结果表明,相比野生型菌株,relA、spot突变菌株的生物膜形成能力均显著上升,且spo T突变菌株的形成能力强于relA突变菌株。代谢活性测定结果表明,spo T和relA基因突变菌株对96种底物的利用代谢较野生型菌株无显著差异。运动性测定结果表明,相比野生型菌株,relA、spot突变菌株的运动能力均显著下降,且spot突变菌株的运动能力比relA突变菌株下降的更明显。逆境诱导可培养性实验结果表明,对高温的耐受性Z-Aq-1△relA高于Z-Aq-1△spot菌株且均高于野生型菌株,对渗透压的耐受性Z-Aq-1△relA高于Z-Aq-1△spot菌株均低于野生型菌株。为此,推测relA和spot基因不参与青枯菌Z-Aq-1菌株的致病调控网络,但对青枯菌Z-Aq-1菌株的运动性、生物膜和生长速率生物学表型具有调控作用。2.野生型菌株与突变菌株的转录组学研究研究明确富营养培养条件和寡营养培养条件下突变菌株与野生型菌株差异表达的基因。在寡营养培养条件下,与野生型菌株相比,relA突变菌株中motA、motB、flg K三个与运动性相关的基因表达量显著下调;spot突变菌株中motA、motB、flgK等十几个与运动性相关的基因表达量显著下调;发现两个突变菌株中TetR、LysR、Asn C、MarR等调控转录因子均差异表达。为此,推测relA、spo T基因参与青枯菌运动性的调控,motA、motB、flgK是调节青枯菌运动性的关键基因。转录组测序结果初步探明了青枯菌中ppGpp调控网络以及发掘新的与运动性相关基因。

关键词：青枯菌 ppGpp relA基因 spot基因转录组

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