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siat7e基因和st3gal Ⅰ基因双表达载体的构建及其初步应用

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中国兽药杂志 2013年第4期47卷 6-10页

作者：陈小云张敏张启龙王磊王栋蒋桃珍中国兽医药品监察所北京100081

应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从人类基因组中扩增出全长为1011 bp的唾液酸转移酶(siat7e基因),并从鸡基因组中扩增出全长为1029 bp的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(ST3GAL Ⅰ)基因。将它们分别克隆入pMD18-T载体中。对扩增的全长si... 详细信息

应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从人类基因组中扩增出全长为1011 bp的唾液酸转移酶(siat7e基因),并从鸡基因组中扩增出全长为1029 bp的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(ST3GAL Ⅰ)基因。将它们分别克隆入pMD18-T载体中。对扩增的全长siat7e基因序列采用BamH Ⅰ和PstⅠ双酶切后连接入pReceiver真核表达载体,构建pRe-SⅠAT重组表达载体,进而,对扩增的全长st3gal Ⅰ基因采用Sac Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,后连接入pRe-siat重组表达载体,构建pRe-siat-ST3重组真核表达载体。经限制性内切酶消化及DNA序列分析,证实构建的重组表达质粒是正确的。将构建的双基因表达载体转染MDCK细胞,利用荧光显微镜观察,可见细胞表达明显的绿色荧光,从而初步证实了外源基因在MDCK细胞中的正确表达。本研究为最终构建能够适应悬浮培养,并且对禽流感病毒更为易感的MDCK细胞系奠定了基础。

关键词： siat7e基因 st3gal Ⅰ基因表达载体 MDCK细胞

稳定表达siat7e基因的MDCK细胞构建

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稳定表达siat7e基因的MDCK细胞构建

作者：谢宝明西北民族大学

学位级别：硕士

犬肾细胞(Madin Darby canine kidney, MDCK)可替代鸡胚用于流感疫苗生产时病毒增殖,其悬浮培养能极大促进流感疫苗的规模化生产。siat7e基因的表达能有效的降低细胞的贴壁依赖性,便于细胞悬浮驯化。本研究通过慢病毒载体系统构建了含... 详细信息

犬肾细胞(Madin Darby canine kidney, MDCK)可替代鸡胚用于流感疫苗生产时病毒增殖,其悬浮培养能极大促进流感疫苗的规模化生产。siat7e基因的表达能有效的降低细胞的贴壁依赖性,便于细胞悬浮驯化。本研究通过慢病毒载体系统构建了含有反转酶识别位点稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞(Flp-In MDCK)。然后共转染pcDNA5/FRT-siat7e载体与Flp重组酶表达载体pOG44,筛选获得了稳定表达siat7e基因的重组细胞MDCK-siat7e。并对其进行了悬浮驯化,获得了以下研究结果：1.构建了稳定表达FRT-LacZ基因的Flp-In MDCK细胞构建了含有3138 bp FRT-LacZ基因的慢病毒重组表达质粒pLVX-FRT-LacZ-PGK-Puro。与包装质粒(pLP1, pLP2, pLP/VSVG)共转染293FT细胞获得重组慢病毒rLV-FRT-LacZ,病毒滴度达4×107TU/mL。重组慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉素筛选2周后,β-半乳糖苷酶原位染色呈蓝色,表明获得了稳定表达FRT-LacZ基因的Flp-In MDCK细胞。2.构建了可定点整合siat7e基因表达载体pcDNA5.0/FRT-siat7e以eX-V1581-M03质粒为模板扩增出约1028 bp siat7e基因,双酶切后克隆至真核表达载体pcDNA5.0/FRT,构建了重组表达载体pcDNA5/FRT-siat7e。3.构建了七株稳定表达siat7e基因的MDCK-siat7e单克隆细胞使用脂质体将重组质粒pcDNA5/FRT-siat7e与重组酶表达质粒pOG44 以 1:9质量比共转染Flp-In MDCK细胞。通过Hygromycin B筛选获得表达siat7e基因MDCK-siat7e细胞。经β-半乳糖苷酶原位染色检测和siat7e基因mRNA的RT-PCR鉴定。采用有限稀释法进行单细胞克隆获得七株单克隆细胞系,命名为MDCK-siat7e (A、B、C、D、e、F、G)。实时荧光定量PCR检测表明,七株细胞中siat7e基因都得到稳定表达,其中MDCK-siat7e(G)细胞siat7e基因表达显著高于MDCK-siat7e(B、C、D、e) (psiat7e(G)与MDCK-siat7e(F、A)细胞中siat7e基因表达差异不显著(p>0.05)。4. MDCK-siat7e细胞的悬浮驯化使用150 mL摇瓶以DMeM、SFM、DM/F12三种培养基分别添加1%NBS对MDCK-siat7e(G)细胞进行了悬浮驯化,其中血清浓度为1%的SFM培养基悬浮驯化效果较好。同时,siat7e基因的表达能显著减低MDCK细胞悬浮驯化过程中的结团现象。

关键词： FRT-LacZ基因慢病毒载体 MDCK细胞位点特异性重组 siat7e基因

稳定表达siat7e基因的MDCK细胞的构建及其功能研究

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稳定表达siat7e基因的MDCK细胞的构建及其功能研究

作者：刘婷中国食品药品检定研究院

学位级别：硕士

传统流感疫苗采用鸡胚作为病毒培养基质,生产周期长、操作繁琐、培养的病毒易突变。细胞基质培养的流感疫苗免疫原性更接近原始病毒,有望替代鸡胚成为新型流感疫苗生产基质。临床试验发现,MDCK细胞生产的流感疫苗在安全性和耐受性方面... 详细信息

传统流感疫苗采用鸡胚作为病毒培养基质,生产周期长、操作繁琐、培养的病毒易突变。细胞基质培养的流感疫苗免疫原性更接近原始病毒,有望替代鸡胚成为新型流感疫苗生产基质。临床试验发现,MDCK细胞生产的流感疫苗在安全性和耐受性方面均优于鸡胚疫苗,但MDCK细胞具有贴壁依赖性,不利于大规模生产,且细胞培养过程中需要的血清具有批次不稳定、成分不清晰等缺点,使用能在无血清培养基中增殖的悬浮细胞生产生物制品是未来的总体趋势。研究表明,siat7e基因可有效降低细胞贴壁性能,本研究采用基因工程技术构建了稳定表达siat7e基因的MDCK单克隆细胞,并在无血清培养基中驯化为悬浮的单细胞MDCK-5G7-S,H3N2疫苗株在该细胞中增殖明显高于贴壁细胞,为悬浮MDCK细胞用于大规模流感疫苗生产奠定基础。在第一部分中,获得了稳定表达siat7e基因的MDCK细胞。首先构建表达载体pcDNA3.1-siat7e/Zeocin,通过电转将其转入MDCK细胞,利用博来霉素抗性筛选结合有限稀释法得到单克隆细胞。然后通过RT-PCR和WB方法分别从mRNA水平和蛋白水平鉴定siat7e基因表达情况,并通过qRT-PCR方法分析siat7e基因相对表达量,得到稳定高表达siat7e基因的MDCK-5G7细胞。在第二部分中,对MDCK-5G7细胞进行悬浮驯化并进行功能研究。首先对OptiPRO SFM、FreeStyle 293、CD293和VirusPro MDCK-S 4种无血清培养基进行筛选,选择可使MDCK-5G7细胞迅速适应的VirusPro MDCK-S培养基进行悬浮驯化,获得在VirusPro MDCK-S无血清培养基中悬浮生长的细胞MDCK-5G7-S。对细胞起始接种密度进行优化,确定最佳接种密度为1×10cells/mL,96h达到最高细胞密度2.45×10 cells/mL,存活率维持在80%以上。选择疫苗株A/Switzerland/9715293/2013(H3N2)按感染复数为0.1分别接种贴壁MDCK、贴壁MDCK-5G7、悬浮MDCK-S和悬浮MDCK-5G7-S细胞,收集12h、24h、48h、72h和96h的病毒并测定CCID滴度,绘制病毒生长曲线,发现病毒在4种培养基中增殖趋势一致。比较48h病毒滴度,悬浮细胞的病毒产量均高于贴壁细胞,siat7e基因的转入进一步提高了病毒滴度,其中MDCK-5G7-S病毒滴度CCID可达10/mL,为流感病毒研究提供新的思路。

关键词：流感病毒 MDCK细胞 siat7e基因悬浮

多基因共稳定表达筛选载体与siat7e稳转MDCK细胞株的构建

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多基因共稳定表达筛选载体与siat7e稳转MDCK细胞株的构建

作者：田聪慧聊城大学

学位级别：硕士

科学研究中构建稳定表达细胞株,抗体工程和细胞工程领域筛选种子细胞经常需要两个或以上的基因稳定共表达。通常通过两个载体共转染的筛选方法来实现,然而实践中常面对许多问题。因此,有必要开发单个载体实现多基因共同表达。MDCK细胞... 详细信息

科学研究中构建稳定表达细胞株,抗体工程和细胞工程领域筛选种子细胞经常需要两个或以上的基因稳定共表达。通常通过两个载体共转染的筛选方法来实现,然而实践中常面对许多问题。因此,有必要开发单个载体实现多基因共同表达。MDCK细胞作为流感病毒疫苗生产的重要细胞系之一,广泛应用于多种病毒的扩增与纯化。但是MDCK细胞贴壁依赖性强,需要表面粘附来进行增殖。因此实现MDCK细胞于悬浮培养中增殖,将简化病毒生产过程,并极大地促进流感病毒的生产规模。本文第一部分是基于IReS序列的多基因共稳定表达筛选载体构建。目的:构建一个IReS序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,连接到骨架载体,构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和eGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和eGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-eGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和Hela两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和eGFP双阳率接近100%。基因组和转录水平PCR及蛋白免疫印迹实验表明DsRed2和eGFP稳定整合到抗性细胞基因组并且两种蛋白表达水平较为一致。结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达,并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白相互作用以及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。本文第二部分是siat7e基因稳定表达的MDCK细胞株的构建。目的:本章节拟构建表达siat7e的MDCK细胞株,用以解决MDCK细胞的悬浮培养问题。方法:利用PCR技术,从MDCK细胞基因组中扩增出全长1011bp的siat7e基因,并将该基因分别克隆到pBflag、pLV-MCS-Puro和pSF-eGFP表达载体中,三种真核表达载体转染MDCK细胞后,筛选siat7e基因稳定表达的MDCK细胞株,以期实现MDCK细胞适应无血清悬浮培养。结果:成功构建了pBflag-siat7e、pLV-siat7e-Puro、pSF-eGFP-siat7e三种表达质粒。pBflag-siat7e重组质粒转染MDCK细胞,抗性筛选获得四个克隆,蛋白质印记和基因组PCR未见siat7e目的条带,推测可能未筛选到siat7e阳性克隆,且细胞未见明显表型。pLV-siat7e-Puro重组质粒转染MDCK细胞,抗性筛选获得MDCK耐药细胞池。基因组和转录水平PCR都证明目的基因siat7e稳定整合到MDCK细胞基因组。同样细胞未见明显表型,降低血清或者无血清培养基培养耐药性MDCK细胞,未获得适应悬浮培养的MDCK细胞系。利用pSF-eGFP-siat7e重组载体,融合表达eGFP和siat7e蛋白,荧光定位siat7e蛋白。荧光倒置显微镜下观察eGFP荧光蛋白表达情况,验证siat7e基因成功转染至MDCK细胞。基因组和转录水平PCR验证,证明siat7e基因稳定整合到MDCK细胞基因组。蛋白荧光定位验证siat7e表达的唾液酸转移酶蛋白定位在内质网上。结论:成功构建了三种表达质粒,并成功筛选获得两种稳定表达siat7e基因的MDCK耐药细胞池,且成功验证唾液酸转移酶蛋白定位,但细胞未见明显表型。接下来,将进一步研究重组质粒转化后MDCK细胞适应悬浮培养的特性。本研究构建的siat7e基因真核表达载体,在转染MDCK细胞后,若能使MDCK细胞适应悬浮培养,将极方便应用MDCK细胞大规模生产流感病毒疫苗。

关键词： IReS 载体构建基因共表达 MDCK细胞 siat7e基因

稳定表达siat7e和st3galI基因MDCK细胞株的建立

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稳定表达siat7e和st3galI基因MDCK细胞株的建立

作者：张启龙中国兽医药品监察所

学位级别：硕士

MDCK细胞是目前公认的最适合禽流感生产的细胞系之一,由于MDCK贴壁性强较难驯化,限制了其在工业化大生产上的应用。唾液酸转移酶(siat7e)基因是控制细胞贴壁程度的重要基因之一,β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(st3galI)基因编码的产... 详细信息

MDCK细胞是目前公认的最适合禽流感生产的细胞系之一,由于MDCK贴壁性强较难驯化,限制了其在工业化大生产上的应用。唾液酸转移酶(siat7e)基因是控制细胞贴壁程度的重要基因之一,β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I(st3galI)基因编码的产物能提高宿主细胞对禽流感病毒的敏感性。本文拟通过对MDCK细胞转染siat7e和st3gall基因来获得适应悬浮培养和可产高滴度禽流感病毒的细胞株。本研究从人和鸡的血液样品中克隆得到siat7e基因和st3gall基因,构建pReceiver-siat7e-st3galI重组表达载体。经双酶切、PCR及DNA测序分析,证实重组载体构建成功。将重组表达载体,以150V,5ms的条件,电击转染MDCK细胞后48h显微镜观察可见绿色荧光,表明双基因成功表达。采用两次有限稀释法挑选到32个单细胞克隆,经基因组PCR和RT-PCR鉴定,得到10株双基因均为阳性的B3-1、B3-2、B3-3、C5、D5、S5-1、CV9、CV10、e2、F2单细胞克隆株。建立了检测siat7e基因和st3galI基因的TaqMan探针相对荧光定量PCR方法,并结合流式细胞筛选技术从挑选的10个单细胞克隆中筛选出一株双基因均稳定高表达的MDCK-C5细胞株。将H9N2A株C5代毒接种贴壁的MDCK和MDCK-C5细胞,血凝效价测定结果表明在MDCK-C5细胞上病毒滴度高于MDCK细胞。采用逐渐降低血清浓度的方法悬浮驯化MDCK-C5细胞株,细胞密度可达1.3×106cells/mL,并且细胞活力维持在60%以上。将禽流感H9N2A株C5代毒接种MDCK-C5悬浮细胞后48h收获病毒,病毒含量eID50可达10-5-69/0.1mL,血凝效价可达2-8。本试验成功获得适应悬浮生长和可产高滴度禽流感病毒的MDCK-C5细胞株,为工业化纯悬浮大规模生产奠定了基础。

关键词： MDCK细胞 siat7e基因 st3galI基因悬浮禽流感病毒H9N2亚型

共表达siat7e和st3galⅠ基因MDCK细胞株的建立

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中国兽药杂志 2014年第3期48卷 1-5页

作者：张启龙陈小云王栋中国兽医药品监察所北京100081

为建立易悬浮驯化和对流感病毒易感的MDCK细胞株,将表达siat7e和st3galⅠ基因的真核表达载体电击转染MDCK细胞,采用有限稀释法、荧光定量PCR和流式细胞术成功筛选到1株双基因共表达MDCK-C5细胞株,且传至12代后仍表达稳定,为流感疫苗工... 详细信息

为建立易悬浮驯化和对流感病毒易感的MDCK细胞株,将表达siat7e和st3galⅠ基因的真核表达载体电击转染MDCK细胞,采用有限稀释法、荧光定量PCR和流式细胞术成功筛选到1株双基因共表达MDCK-C5细胞株,且传至12代后仍表达稳定,为流感疫苗工业化大规模生产奠定了基础。

关键词： MDCK细胞 siat7e基因 st3gal I基因