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sirna干扰Smo基因对人肝癌HepG2细胞生物学特性影响的研究

siRNA干扰Smo基因对人肝癌HepG2细胞生物学特性影响的研究

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作者：张雷蚌埠医学院

学位级别：硕士

肝癌是世界常见恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌(hepatocelluarcarcinoma，HCC)是最主要的类型，其特点是侵袭力强、易转移、预后差，它由多种基因参与，涉及多条信号通路。在我国，肝癌发病率极高，约占全世界的42.5%。自20世纪90年代以来... 详细信息

肝癌是世界常见恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌(hepatocelluarcarcinoma，HCC)是最主要的类型，其特点是侵袭力强、易转移、预后差，它由多种基因参与，涉及多条信号通路。在我国，肝癌发病率极高，约占全世界的42.5%。自20世纪90年代以来，我国肝癌死亡率为20～40/10万，高居癌症死亡率的第2位，且5年生存率极低。大量实验证明，肝癌的发生是由多种基因参与，涉及多条信号通路的多步骤、多阶段的发生过程，但目前发病机制尚不清楚。且对于肝癌的早期诊断及治疗也缺乏有效的手段。通过对肝癌相关的基因研究，不仅可以进一步明确肝癌的发生机制，以及提供新的靶向生物治疗肝癌。近年来，研究发现很多在胚胎发育、组织分化过程中起调控作用的信号通路同样在肿瘤发生的过程中发挥着重要的作用，其中包括Sonichedgehog信号通路、EGFR信号通路、TGF-β信号通路、Wnt信号通路等。这些通路的发现和研究，为肿瘤发生机制的研究及新的治疗途径提供了新方向。 Smoothened(Smo)蛋白是Sonichedgehog信号通路中的信息转换器，能够把细胞外的SHh信号转换成细胞内的Glil信号，从而启动细胞核内基因的转录，对Sonichedgehog信号通路具有激活作用。正常组织和细胞中，Smo不表达或低表达，维持细胞正常代谢需要。当Smo过表达时，可异常激活Hedgehog通路，产生大量促癌因子，使细胞发生转化和恶变。研究表明，Smo在一些人类肿瘤，如恶性胶质瘤、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、基底细胞癌等组织中高表达。有学者认为，Smo有望成为肿瘤基因治疗的新靶点和早期诊断、评估预后的新指标。本课题拟应用Westernblot及半定量RT-PCR技术，旨在观察Smo基因在肝癌HepG2细胞中的表达及其对肝癌HepG2细胞影响的作用。RT-PCR及Westemblot检测肝癌HepG2细胞中Smo基因的表达;利用rnai技术sirna脂质体介导转染肝癌HepG2细胞，MTT法和流式细胞仪检测肝癌HepG2细胞smomRNA被降解后对细胞的影响。探讨Smo基因在肝癌细胞增殖和凋亡过程中的作用。目的：探讨Smo基因在肝癌细胞增殖和凋亡过程中的作用及与肝癌的关系，为Smo基因在Sonichedgehog信号通路上能否靶向治疗肝癌提供实验依据。材料和方法： 1.细胞来源：本实验所使用的人肝癌HepG2细胞株由安徽医科大学老师赠与。试剂：Trizol（总RNA提取试剂异硫氰酸胍)、FSK-100(RT-PCR试剂盒)、兔抗人Smo浓缩型多克隆抗体（一抗）、Annexin-V凋亡检测试剂盒、辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体(二抗)、MTT等。主要设备：C02恒温孵育箱、PCR扩增仪、流式细胞仪、转印电印电泳槽、DYY-B型电泳仪。 2.实验方法：(1)细胞培养:HepG2细胞在培养基(含1.0mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸和1.5克/升碳酸氢钠的EMEM，添加10%胎牛血清。)于37℃、5％CO2孵箱中培养，实验所用细胞均处于对数生长期。（2）RT-PCR检测肝癌HepG2细胞SmomRNA的表达（3）Westernblot检测HepG2细胞Smo蛋白的表达（4）sirna序列的设计与合成：sirna-1、sirna-2、sirna-3，及1对非特异性sirna（5）细胞转染及sirna筛选：分成A、B、C、D、E五组：A组为转染特异性sirna-1组，B组为转染特异性sirna-2组、C组为转染特异性sirna-3组，D组为阳性对照组(转染非特异性sirna)，E组为阴性对照组(转染时只加Lipofectamine，不加任何sirna)，每组设6个重复孔。(6)rnai技术分别将Smosirna转染入各组人肝癌HepG2细胞内;(7)RT-PCR技术检测转染48小时后各组细胞的SmomRNA表达，比较3组特异组表达的效果，筛选出抑制最有效的sirna，后继实验中均以该特异性sirna转染的细胞为实验组;(8)再将HepG2细胞分成实验组、阳性对照组、阴性对照组，每组设6个重复孔进行转染;（9）噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡率;（10）统计学方法分析：数据采用SPSSl8．0软件进行统计分析。结果： l、Westernblot及半定量RT-PCR结果显示发现人肝癌HepG2细胞内有Smo蛋白及SmomRNA的高表达。 2、按照分组，转染48h后，RT-PCR结果显示：sirna-1组、sirna-2组、sirna-3组及阳性对照组与阴性对照组的HepG2细胞的SmomRNA表达水平有显著性差异(F=382.0，Psirna-1组表达水平最低，sirna-2组次之，两组分别与阴性

关键词：肝癌 Sonichedgehog信号通路 Smo基因 sirna rnai

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