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In silico sgrna tool design for CRISPR control of quorum sensing in Acinetobacter species

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Genes & Diseases 2018年第2期5卷 123-129页

作者： Abraham Peele Karlapudi Venkateswarulu T.C Jahnavi Tammineedi Krupanidhi Srirama Lohit Kanumuri Vidya Prabhakar Kodali Department of Biotechnology Vignan’s Foundation for Science Technology and ResearchVadlamudiGuntur 522213India Department of Biotechnology Vikrama Simhapuri UniversityNelloreIndia

CRISPR genome editing utilizes Cas9 nuclease and single guide RNA(sgrna),which directs the nuclease to a specific site in the genome and makes a double-stranded break(DSB).Design of sgrna for CRISPR-Cas targeting,and to promote CRISPR adaptation,uses a regulatory mechanism that ensures maximum CRISPR-Cas9 system functions when a bacterial population is at highest risk of phage *** baumannii is the most regularly identified gram-negative bacterium infecting *** reports have demonstrated that the extent of diseases caused by *** is expanding and,in a few cases,now surpasses the quantity of infections caused by *** Acinetobacter strains possess biofilm-forming ability,which plays a major role in virulence and drug *** bacteria use quorum sensing,a cell-to-cell communication process,to activate gene *** genes are involved in biofilm formation and the mechanism to disrupt the biofilm network is still not clearly *** this study,we performed in silico gene editing to exploit the AbaI gene,responsible for biofilm *** study explored different tools available for genome editing to create gene knockouts,selecting the *** AbaI gene as a target.

关键词： AbaI Acinetobacter baumannii CHOPCHOP Crispr-cas9 sgrna

CRISPR/Cas9系统中sgrna设计与脱靶效应评估

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遗传 2015年第11期37卷 1125-1136页

作者：谢胜松张懿张利生李广磊赵长志倪攀赵书红华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室武汉430070 中国人民解放军第161医院妇产科武汉430010

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sg RNA(Small gu... 详细信息

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sg RNA(Small guide RNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。目前,已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sg RNA设计和/或脱靶效应评估软件,但不同的软件各有优缺点。本文重点对16款sg RNA设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述,通过制定38项评估指标对不同软件进行了比较分析,最后对11种用于检测基因组编辑效率和脱靶的实验方法,以及如何筛选高效且特异的sg RNA进行了归纳总结。

关键词： CRISPR/Cas9系统基因组编辑 sgrna 脱靶效应

番茄红素合成调控基因SISGR1的分子特征及sgrna分析

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西北农业学报 2022年第8期31卷 1017-1024页

作者：刘江娜张西英李荣霞张小伟白云凤张爱萍新疆生产建设兵团第六师农业科学研究所新疆五家渠831300

旨在明确番茄SISGR1基因的分子特征及其sgrna的分布,为利用CRISPR/Cas9技术对SISGR1及其上游启动子序列进行定点突变或片段删除、调控SISGR1的表达为提高番茄果实的番茄红素含量提供技术支持。利用Blast分析番茄红素合成调控基因SlSGR1... 详细信息

旨在明确番茄SISGR1基因的分子特征及其sgrna的分布,为利用CRISPR/Cas9技术对SISGR1及其上游启动子序列进行定点突变或片段删除、调控SISGR1的表达为提高番茄果实的番茄红素含量提供技术支持。利用Blast分析番茄红素合成调控基因SlSGR1的分子特征,结果表明SISGR1基因位于番茄第8号染色体,含4个外显子和3个内含子,编码区长度为819nt,编码272aa,其中48~200aa为典型的staygreensuperfamily保守结构域。基于对RNA-seq建立的SISGR1数字表达谱分析表明,SISGR1呈果实特异性表达,在植株的根、茎、叶等部位不表达。利用在线工具CRISPRdirect分析表明,SlSGR1外显子区域含有PAM为NGG的sgrna有64条,其中1条为番茄全基因组上唯一邻近PAM12nt特异性最高的种子序列,预示该sgrna可用于番茄不同品种SISGR1基因的靶向编辑并可有效避免脱靶效应。对SISGR1上游1500bp启动子序列分析表明,该序列含有2条番茄全基因组上特异性较好的唯一sgrna序列,7条分别含有不同顺式元件的sgrna,意味着选用这些sgrna进行基因编辑,可使所含的启动子元件序列发生突变致使功能变化,以提高番茄红素含量。

关键词：番茄 SISGR1 分子特征启动子 sgrna

CRISPR/Cas9-sgrna全基因组文库筛选人单核细胞白血病功能性促癌/抑癌基因体系的建立与优化

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中国科学：生命科学 2016年第7期46卷 839-850页

作者：陈晨郝莎白杨张健萍张孝兵程涛中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所实验血液学国家重点实验室天津300020 中国医学科学院干细胞医学中心天津300020 北京协和医学院干细胞与再生医学系天津300020 Department of Medicine Loma Linda University 肿瘤医学协同创新中心天津300020

CRISPR/Cas9-sg RNA(single guide RNA)全基因组文库筛选技术是在哺乳动物中进行系统基因组分析的有力工具.本文通过在人急性单核白血病细胞系THP1上优化CRISPR/Cas9-sg RNA人类全基因组慢病毒文库感染体系,构建裸鼠皮下移植肿瘤模型,... 详细信息

CRISPR/Cas9-sg RNA(single guide RNA)全基因组文库筛选技术是在哺乳动物中进行系统基因组分析的有力工具.本文通过在人急性单核白血病细胞系THP1上优化CRISPR/Cas9-sg RNA人类全基因组慢病毒文库感染体系,构建裸鼠皮下移植肿瘤模型,并通过优化测序建库方法,对肿瘤组织进行二代测序以及利用生物信息学分析获得筛选结果.裸鼠肿瘤模型表明,感染sg RNA文库后的THP1细胞成瘤能力下降,推测可能与某些促癌基因的敲除有关;通过对二代测序数据进行生物信息学分析得到了一些候选基因.实验结果表明,在人单核细胞白血病细胞系上进行CRISPR/Cas9-sg RNA全基因组文库筛选是可行的,这项工作为在其他白血病细胞系或原代细胞上的筛选应用奠定了一定基础.

关键词： CRISPR/Cas9 sgrna THP1 基因筛选二代测序

靶向miRNA前体不同类型sgrna的丰度及特异性评估

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遗传 2018年第7期40卷 567-577页

作者：刘海龙谌阳高杨周玲韩晓松赵长志杨高娟陈毅龙杨慧谢胜松华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室武汉430070 华中农业大学动物医学院基础兽医系武汉430070 华中农业大学生猪健康养殖协同创新中心武汉430070

CRISPR/Cas技术能高效进行基因组定点编辑,但不同细菌来源或人工改造的Cas9以及Cpf1等核酸酶识别的PAM(protospacer adjacent motif)有差异,因此不同的基因编辑核酸酶可能采用不同类型的sgrnas(small guide RNAs)。Micro RNAs(miRNAs)... 详细信息

CRISPR/Cas技术能高效进行基因组定点编辑,但不同细菌来源或人工改造的Cas9以及Cpf1等核酸酶识别的PAM(protospacer adjacent motif)有差异,因此不同的基因编辑核酸酶可能采用不同类型的sgrnas(small guide RNAs)。Micro RNAs(miRNAs)是一类调控性的小分子非编码RNAs,为了研究miRNA前体中是否可能存在特异性高的sgrnas靶点,本文利用本课题组前期开发的生物信息学软件CRISPR-offinder,对靶向28 645条miRNA前体的11种不同类型sgrna的丰度及特异性进行了分析,并利用CRISPR/Cas9慢病毒技术构建了猪miR-302/367基因簇敲除细胞系,对构建的猪miRNA敲除细胞系的效率进行了检测。结果表明,每个miRNA前体中平均存在约8种不同类型sgrna的靶点;通过评估靶向猪miRNA前体sgrna的脱靶效应,发现其中特异性高的sgrna仅占18.2%;通过CRISPR/Cas9慢病毒技术成功构建了猪miR-302/367基因簇敲除细胞系,发现通过该技术构建miRNA敲除细胞系的效率为40%。本研究为利用CRISPR/Cas技术靶向敲除miRNA提供了重要资源。

关键词：猪 miRNA CRISPR/Cas9 sgrna 敲除

番茄SlLCY-B2及其启动子的分子特征和sgrna分析

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新疆农业科学 2023年第6期60卷 1460-1465页

作者：刘江娜张西英李荣霞张小伟白云凤张爱萍新疆生产建设兵团第六师农业科学研究所新疆五家渠831300

【目的】番茄红素合成后会在β-番茄红素环化酶SlLCY-B(lycopene-β-cyclase)催化下进入代谢途径,抑制SlLCY-B2的表达可增加番茄红素的积累。对番茄红素代谢调控基因SlLCY-B1的分子特征及sgrna进行系统分析,为利用CRISPR/Cas9技术对SlLC... 详细信息

【目的】番茄红素合成后会在β-番茄红素环化酶SlLCY-B(lycopene-β-cyclase)催化下进入代谢途径,抑制SlLCY-B2的表达可增加番茄红素的积累。对番茄红素代谢调控基因SlLCY-B1的分子特征及sgrna进行系统分析,为利用CRISPR/Cas9技术对SlLCY-B2及其上游启动子序列进行定点突变或片段删除、调控SlLCY-B2的表达以减少代谢的途径,提高番茄果实的番茄红素含量。【方法】利用生物在线工具,对SlLCY-B2多肽特性及保守结构域、基因组结构、数字表达谱、启动子顺式作用元件进行系统分析,根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,设计筛选出适宜的sgrna。【结果】SlLCY-B2位于番茄6号染色体,编码498个氨基酸,gDNA不含内含子,呈果实特异性表达。SlLCY-B2分布145条sgrna,其中21条有高特异性。SlLCY-B2上游-1500 bp启动子序列分布15个顺式作用元件和112条sgrna。【结论】对SlLCY-B2和其启动子区进行基因编辑,可调控SlLCY-B2的表达,将提高番茄红素含量。

关键词：番茄 SlLCY-B2 分子特征启动子顺式元件 sgrna

基于核酶的自剪切sgrna及其在基因编辑中的应用

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四川大学学报（自然科学版） 2019年第2期56卷 345-350页

作者：单策李中瀚四川大学生命科学学院成都610064

为减少在CRISPR/Cas9基因编缉系统中,sgrna通常由Ⅲ型启动子持续转录产生,Ⅲ型启动子不易控制,sgrna持续表达又容易产生细胞毒性这一缺陷,本文拟建立由Ⅱ型启动子转录,并由内含子中释放sgrna的方法.我们在sgrna的两端设计了三种"核酶-sg... 详细信息

为减少在CRISPR/Cas9基因编缉系统中,sgrna通常由Ⅲ型启动子持续转录产生,Ⅲ型启动子不易控制,sgrna持续表达又容易产生细胞毒性这一缺陷,本文拟建立由Ⅱ型启动子转录,并由内含子中释放sgrna的方法.我们在sgrna的两端设计了三种"核酶-sgrna-核酶"的组合,通过核酶的自剪切作用实现sgrna的释放.实验结果表明,HHRz-sgrna-HDVRz的设计能够正确的从内含子中释放sgrna,并且该sgrna在构建的copGFP敲除模型中能够实现有效的基因编辑.这一发现证明在哺乳动物细胞中利用Ⅱ型启动子,在核酶和内含子剪切的协助下可以实现sgrna的表达,这为Cas9和sgrna整合在一个Ⅱ型启动子之下实现组织特异性和药物诱导性表达提供了基础.

关键词： CRISPR/Cas9系统内含子核酶 sgrna

基于Transformer复合模型的sgrna打靶活性预测方法

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基于Transformer复合模型的sgRNA打靶活性预测方法

作者：万蕴琦华东师范大学

学位级别：硕士

CRISPR/Cas9系统是目前广泛使用的基因组编辑工具,在疾病治疗、基因功能调控等方面具有广阔的应用前景。然而,如何准确预测和评价单导RNA(sg RNA)的打靶和脱靶效应是CRISPR/Cas9系统设计的一个关键问题,利用计算方法获得高敏感性和特异... 详细信息

CRISPR/Cas9系统是目前广泛使用的基因组编辑工具,在疾病治疗、基因功能调控等方面具有广阔的应用前景。然而,如何准确预测和评价单导RNA(sg RNA)的打靶和脱靶效应是CRISPR/Cas9系统设计的一个关键问题,利用计算方法获得高敏感性和特异性的sg RNA是开展sg RNAs优化设计的重要前提。目前,研究人员提出了许多用于sg RNA打靶预测的模型,尽管这些模型在预测能力方面取得了显著的效果,但在特征处理与模型架构方面仍存在提升空间。本文围绕如何提升模型预测sg RNA打靶活性的能力展开,主要内容与创新点概况如下:(1)提出了一个新的基于Transformer与CNN架构的sg RNA打靶活性预测模型Trans Crispr。Trans Crispr从多个层次对sg RNA的序列特征进行捕获,并通过Transformer结构在保证对序列信息进行全面学习的前提下重点关注有生物学意义的序列片段,有效提升模型的预测能力。同时对Transformer模块展开针对性的改进,引入动态残差结构,有效防止了信息损失与梯度消失。(2)在Trans Crispr模型的基础上提出了使用序列特征融合与生物学特征集成的方法,进一步增强模型的预测准确性。在特征方面,使用单碱基与二聚体混合的方式进行编码,实现了序列数据增广。在模型方面,将生物学特征学习模块与Trans Crispr模型进行集成,得到多特征融合的集成模型,提升了模型的鲁棒性。此外,基于Trans Crispr模型对进行了特征重要性分析,通过算法揭示模型训练过程中的生物学意义。(3)基于提出的预测模型,开发了sg RNA打靶活性预测工具,可以实现在多个Cas9基数据集下的sg RNA活性与生物学特征预测。本文在广泛使用的sg RNA数据集上与主流方法进行了比较,实验结果表明,本文提出的预测模型优于主流方法,同时也验证了多特征融合方法的有效性,为基因编辑实验提供了参考。

关键词： CRISPR/Cas9 sgrna 深度学习神经网络 Transformer

十二指肠贾第虫sgrna启动子的筛选及其转染系统的构建

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十二指肠贾第虫sgRNA启动子的筛选及其转染系统的构建

作者：石东东东北农业大学

学位级别：硕士

十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)简称贾第虫,是一种重要的人兽共患原虫,由贾第虫寄生在宿主小肠中,感染并引起的贾第虫病(giardiasis)呈世界性分布,其引起感染者的主要症状是腹泻。贾第虫的宿主广泛,包括多种脊椎动物。贾第虫属于... 详细信息

十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)简称贾第虫,是一种重要的人兽共患原虫,由贾第虫寄生在宿主小肠中,感染并引起的贾第虫病(giardiasis)呈世界性分布,其引起感染者的主要症状是腹泻。贾第虫的宿主广泛,包括多种脊椎动物。贾第虫属于单细胞真核生物,其结构简单,基因含量少且紧凑,编码区极短。贾第虫生活史非常简单,仅有感染期可长期抵抗外界不良环境而存在的包囊和成熟期可复制繁衍导致疾病产生的滋养体两个阶段。人类由于食用或饮用了被包囊污染的食物和水而引起贾第虫感染,贾第虫常导致宿主腹泻、恶心、呕吐和体重减轻,还可引起肠易激综合征(IBS)、食物过敏、关节炎或慢性疲劳综合症等多种并发症。营养状况、免疫状态、混合感染和肠道正常菌群的差异都会影响贾第虫的感染能力。贾第虫属于真核生物的分支,位于真核生物进化的底端,是研究高等真核生物进化的重要生物模型。近年来,可编辑核酸酶的引入极大提高了基因组编辑的效率。目前研究人员使用最广泛的是CRISPR工具,应用该工具切断基因组双链DNA,从而产生基因组的变异。CRISPR/Cas9属于II型CRISPR系统,最初是在细菌和古细菌中发现的,有两种关键性构建核心:Cas9蛋白和sgrna,sgrna由tracrRNA和crRNA结合的复合物组成,在细胞内被内切酶III水解间隔区和部分重复序列形成成熟的sgrna。在最后一步干扰中,sgrna将Cas9蛋白引导到一个与sgrna互补的靶序列然后将其降解。在构建细胞的CRISPR/Cas9基因编辑系统时,需要构建出表达sgrna和Cas9蛋白的质粒,质粒中插入抗药基因表达盒,借助转染技术将质粒运送至细胞,再用药物筛选出稳定表达细胞系,进行基因编辑研究。这种编辑方法比传统方法更简便和省时,目前已经应用在各种生物领域。本研究以CRISPR/Cas9系统中的关键结构之一的sgrna为研究对象,构建出贾第虫sgrna瞬时和稳定转染载体。实验分析了已发表文章的锥虫和弓形虫中的敲除载体中的功能元件,并预测了贾第虫U6启动子,将锥虫U6、弓形虫18S rRNA的两种外源启动子和预测的贾第虫内源的U6启动子作为sgrna的候选启动子来启动sgrna的转录。以pBluescript II SK(+)为真核转染载体骨架,将三种sgrna表达盒插入pBluescript质粒,构建且鉴定成功后,利用质粒大提的方法将三种质粒提取纯化,通过电穿孔的方式将质粒转染入贾第虫细胞中,转染并培养24 h后提取滋养体总RNA,反转录得到cDNA,qPCR分析三种启动子的启动效果和能力。鉴定成功的质粒再通过电转染至贾第虫之后,取不同时间点进行qPCR检测,分析瞬时转染sgrna的表达时间。为检验3’UTR对sgrna的转录是否有影响,本研究将U6的3’UTR用插入到瞬时转染载体中sgrna基因的3’端,构建出pBSK-GU5-sgrna-GU3质粒,将pBSK-GU5-sgrna和pBSK-GU5-sgrna-GU3两种质粒通过电转染贾第虫后,用qPCR技术分析两种载体的sgrna的表达量。在鉴定成功的转染载体内插入NEO表达盒构建出稳定转染载体pBSK-GU5-sgrna-RNR,同时通过G418浓度梯度培养贾第虫来确定G418对贾第虫的最小致死量。用内切酶将稳定转染质粒线性化并回收之后用电转染至贾第虫内,在含G418药物的培养基中筛选出sgrna稳定表达虫株,提取基因组DNA,PCR鉴定NEO和sgrna基因。通过以上研究,本研究成功构建出sgrna瞬时转染载体,并用qPCR技术检测到sgrna成功被贾第虫U6启动子转录,其瞬时表达时间为6 d,再插入NEO表达盒构建出稳定转染载体,通过转染之后的G418药物筛选,本研究成功得到稳定表达sgrna的抗G418虫株,并用PCR方法鉴定出sgrna及NEO基因,表明稳定转染实验成功。本研究同时通过实验证明贾第虫U6的3’UTR对sgrna的转录表达无显著影响。本研究通过预测及筛选分析,成功得到贾第虫内源性sgrna启动子,在贾第虫内成功地进行瞬时转染和稳定转染,为CRISPR/Cas9系统在贾第虫中的成功建立及利用该技术对贾第虫基因功能的进一步研究提供理论依据。

关键词：十二指肠贾第虫 CRISPR/Cas9 sgrna 稳定转染