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家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3及相互作用蛋白研究

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3及相互作用蛋白研究

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作者：王明慧苏州大学

学位级别：硕士

丝氨酸蛋白酶抑制剂超基因家族，参与调节生物体内多种生理反应。为深入研究丝氨酸蛋白酶抑制剂及互作因子在家蚕免疫防御中的作用机制，本文以家蚕为材料，做了如下研究：以脂肪体cDNA为模板克隆了家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin-3)基... 详细信息

丝氨酸蛋白酶抑制剂超基因家族，参与调节生物体内多种生理反应。为深入研究丝氨酸蛋白酶抑制剂及互作因子在家蚕免疫防御中的作用机制，本文以家蚕为材料，做了如下研究：以脂肪体cDNA为模板克隆了家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin-3)基因。利用原核表达系统表达了Bmserpin-3的编码区，并纯化了表达产物，利用纯化的蛋白，研究了Bmserpin-3参与家蚕黑化作用的机理;采用His-pull down技术筛选了与家蚕serpin-3相互作用蛋白;用RNAi结合荧光定量PCR的方法研究了Bmserpin-3对靶标蛋白的调控。主要研究结果如下： 1家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3基因的克隆本实验以家蚕幼虫脂肪体cDNA为模板，扩增获得了家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3的基因序列(GenBank登录号NP01040318.1)。克隆的家蚕serpin-3基因开放阅读框含1311bp，编码458个氨基酸，预测蛋白质分子量约为49.33kD，等电点约为5.28，信号肽是前22个氨基酸残基，395-416是预测的活性位点，410位的Lys是预测的P1位点。 2家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3基因的原核表达将Bmserpin-3的编码区克隆到表达载体pET-28a(+)，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经0.5mmol/L IPTG诱导进行原核表达。SDS-PAGE电泳分析表明，转化了serpin-3重组载体的BL21菌，在约49kD位置出现了特异性条带，而对照组BL21菌、空pET-28a(+)转化的BL21菌、非诱导转化去信号肽的pET-28a-Bmserpin-3重组菌与诱导转化去信号肽的pET-28a-Bmserpin-3重组菌在同一位置则没有出现此特异条带，说明Bmserpin-3在大肠杆菌中得到表达，并对其进行了纯化。 3家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3参与黑化作用家蚕serpin-3与果蝇、烟草天蛾、冈比亚按蚊参与黑化作用的serpin序列比对，发现它们的同源性很高。用LPS诱导后不同时间分别测定serpin-3的蛋白浓度和PO活性，发现其浓度在LPS处理后较对照有所增加，PO活性升高，而在添加Bmserpin-3后，PO活性则有所降低，且随着添加Bmserpin-3剂量的增加，其PO活性受抑制更明显，说明Bmserpin-3抑制黑化作用。 4家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3相互作用蛋白的研究利用透析纯化技术将获得的原核表达重组融合蛋白进行纯化，经SDS-PAGE检测，纯化蛋白分子量大小与预测的一致，且目的蛋白纯度很高，以此蛋白作为诱饵蛋白，用His pull-down方法筛选了与家蚕血液中serpin-3相互作用的蛋白，经质谱分析，相互作用蛋白为家蚕储存蛋白(silkworm storage protein)，性别特异储存蛋白2(sex-specific storage-protein2precursor)，主要参与免疫，细胞凋亡等。 5家蚕serpin-3靶标蛋白的研究设计3对siRNA片段，转染家蚕卵巢细胞BmN，筛选获得干扰效果显著的片段。并将有效片段转染家蚕五龄第三天幼虫后用荧光定量PCR方法检测Bmsp2，3的表达量。结果显示，经Bmserpin-3干扰后，Bmsp2表达量显著下降，而Bmsp3表达量有所下降但不显著。推测Bmserpin-3或许能通过降低Bmsp2的mRNA水平从而引起sp2蛋白水平下降，而Bmsp3在mRNA的水平变化不大，说明Bmserpin-3没有影响Bmsp3的mRNA水平，可能在转录后翻译及翻译后水平参与了对sp3蛋白表达的调控。本文成功克隆了家蚕serpin-3基因并进行了原核表达，利用纯化的表达蛋白，鉴定了其相互作用蛋白，研究发现seripin-3参与免疫黑化反应。

关键词：家蚕 serpin-3基因 pull-down RNAi 黑化作用

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