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上海交通大学学报（医学版） 2018年第3期38卷 254-258页

作者：胡戌琛王玉霞江文欣牛晨光林文珍黄正蔚上海交通大学医学院附属第九人民医院牙体牙髓科上海市口腔医学重点实验室/上海市口腔医学研究所国家口腔疾病临床研究中心上海200011 天津市口腔医院/南开大学口腔医院牙体牙髓科天津300041

目的·研究sahh基因在变异链球菌LuxS缺陷株内的表达对其胞外多糖合成的影响。方法·以构建的LuxS缺陷株转有sahh基因的sahh+LuxS-SmUA159、LuxS缺陷株转有空质粒的PIB169+LuxS-SmUA159(背景对照)及变异链球菌SmUA159野生株为研究模型... 详细信息

目的·研究sahh基因在变异链球菌LuxS缺陷株内的表达对其胞外多糖合成的影响。方法·以构建的LuxS缺陷株转有sahh基因的sahh+LuxS-SmUA159、LuxS缺陷株转有空质粒的PIB169+LuxS-SmUA159(背景对照)及变异链球菌SmUA159野生株为研究模型。实时荧光定量PCR观察胞外多糖合成相关基因的转录水平,蒽酮法观察生物膜胞外多糖合成情况。结果·与SmUA159和PIB169+LuxS-SmUA159菌株相比,sahh基因转入株sahh+LuxS-SmUA159的4种被检测基因(gtfA、gtfB、gtfC、gtfD)中,gtfA和gtfD转录水平有显著差异(均Psahh+LuxS-SmUA159胞外多糖合成量无明显差异。结论·sahh基因转入可影响变异链球菌胞外多糖合成相关基因的表达,但不影响细菌总体胞外多糖合成量。

关键词：变异链球菌胞外多糖基因表达细菌 sahh基因

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大肠杆菌密度感应缺陷株中sahh基因克隆与表达的研究

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口腔医学 2011年第8期31卷 449-452页

作者：王倩黄正蔚上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔医学院牙体牙髓病科上海市口腔医学重点实验室上海200011

目的利用克隆和表达sahh基因,恢复大肠杆菌密度感应缺陷株的甲基循环通路。方法通过扩增铜绿假单胞菌sahh基因,克隆到pGEX4T-1载体上,继而转入大肠杆菌密度感应缺陷株。诱导培养后,经考马斯亮蓝染色及蛋白印迹鉴定sahh-GST融合蛋白的表... 详细信息

目的利用克隆和表达sahh基因,恢复大肠杆菌密度感应缺陷株的甲基循环通路。方法通过扩增铜绿假单胞菌sahh基因,克隆到pGEX4T-1载体上,继而转入大肠杆菌密度感应缺陷株。诱导培养后,经考马斯亮蓝染色及蛋白印迹鉴定sahh-GST融合蛋白的表达。结果成功扩增并克隆了sahh基因,在大肠杆菌密度感应缺陷株中表达出约75 ku大小的蛋白,其大小与sahh-GST蛋白相符。结论大肠杆菌密度感应缺陷株内可以表达外源基因sahh,恢复了甲基循环的该菌株可进一步应用于密度感应与代谢循环调节作用的实验。

关键词：密度感应 sahh基因克隆蛋白印迹

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甲硫氨酸代谢通路对禽致病性大肠杆菌调控机制的研究

甲硫氨酸代谢通路对禽致病性大肠杆菌调控机制的研究

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作者：徐达扬州大学

学位级别：硕士

禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一种禽类局部或全身性传染病,其广泛的耐药性和复杂的血清型,一直制约对该病的防控,并对全球的养禽业造成重大的经济损失。存在于革兰氏阴性和阳性细... 详细信息

禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一种禽类局部或全身性传染病,其广泛的耐药性和复杂的血清型,一直制约对该病的防控,并对全球的养禽业造成重大的经济损失。存在于革兰氏阴性和阳性细菌中的LuxS/AI-2型密度感应系统,可产生通用自诱导信号分子AI-2 (Autoinducer,AI-2)。AI-2可与细菌受体结合,进一步诱导胞内相关基因的表达,最终调节自身的生理特性。AI-2的产生涉及微生物甲硫氨酸代谢通路(Activated methionine cycle, AMC),细菌可采用pfs/luxS和sa hH两种AMC代谢通路,而不同的代谢通路对APEC的调控机制以及应用甲硫氨酸代谢通路防治APEC的方法仍有待研究。本研究通过在APEC中构建不同甲硫氨酸代谢通路,探讨APEC在采用不同的甲硫氨酸代谢通路下对其致病性的影响,为研究APEC的致病机理提供基础,其中阻断或者改变APEC甲硫氨酸代谢通路的方法对APEC的诊疗及防控技术具有重要的应用价值。一.甲硫氨酸代谢通路中IuxS、pfs和sahh基因的克隆、表达以及体外活性验证为了验证在禽致病性大肠杆菌DE17株中构建甲硫氨酸sahh代谢通路的可行性,本研究构建了原核表达载体pET28a-luxS, pET28a-pfs 以及ET28a-sahh;可溶性分析结果表明,重组蛋白Pfs, LuxS和sahh蛋白在大肠杆菌中均为可溶性表达。体外活性实验分析结果表明,重组蛋白LuxS和Pfs同时与SAH作用后可产生400μmol/L的同型半胱氨酸(Homocysteine, HCY),而在相同条件下sahh蛋白只能催化SAH产生47.3 μmol/L的HCY。本研究成功获得了具有生物催化活性的Pfs、LuxS和sahh蛋白,验证了在DE17内构建sahh循环途径的可行性,为后续研究AMC通路对APEC致病性的影响奠定基础。二.APEC中不同甲硫氨酸代谢通路的构建为了在APEC中构建不同的甲硫氨酸代谢通路,本研究成功构建阻断pfs/luxS代谢通路的DE17Δpfs。由于APEC不具备sahh代谢通路,本研究构建了铜绿假单胞菌sahh基因的回复性载体pSTV-sahh,并分别转化至DE17和DE17Δpfs中,分别得到存在pfs/luxS和sahl俩种AMC通路的互补株sahh-DE17和只存在sahh甲硫氨酸代谢通路的互补株sahh-DE17Δpfs。Real-time PCR检测结果表明,sahh基因在sahh-DE17和sahh-DE17Δpfs中成功转录。AI-2活性检测实验证实,DE17Δpfsfs和sahh-DE17Δpfs的生长过程中不产生AI-2。与野生株DE17相比,sahh-DE 17的AI-2的生成受到明显抑制,至第6小时最为显著。本研究成功在APEC野生株DE17和缺失株DE17△pfs中,构建了甲硫氨酸sahh代谢通路,为进一步开展利用阻断或者改变甲硫氨酸代谢通路调节APEC致病性的应用型研究提供基础。三.不同甲硫氨酸代谢通路对APEC致病性的影响为了研究不同甲硫氨酸代谢通路对APEC致病性的影响,本研究开展了如下生物学特性研究：1)生长曲线测定。sahh-DE 17的生长快于DE17,而DE17Δpfs和sahh-DE17Δpfs的生长特性无显著差异,但均比DE17显著缓慢。2)LD50测定。与野生株DE17 (LD50为1.24×103 CF U)相比, DE17Δpfs (LD50为8.06×105CFU)毒力降低650倍,sahh-DE17Δpfs (LD50为6.49×104 CFU)毒力降低52.3倍,而sahh-DE17 (LD50)为4.22×103 CFU)毒力无显著变化。3)体内分布测定。与野生株DE17(血液：2.1×106CFU/mL;肝脏：1.7×107 CFU/g;脾脏：2.3×108 CFU/g;肾脏：4. 1×108 CFU/g)相比,DE17Δpfs (血液：1.6×102 CFU/mL肝脏：7.5×102 CFU/g脾脏：1.1×104 CFU/g;肾脏：1.4×104 CFU/g)的载菌量显著降低(Psahh-DE17Δpfs (血液：2.7×104CFU/mL肝脏：2.8×10s CFU/g;脾脏：8.9×104 CFU/g;肾脏：9.6×105 CFU/g)的载菌量显著降低(Psahh-DE17仅在肝脏的载菌量比DE17显著降低(肝脏,P<0.001),在其他脏器或血液内无明显差异。4)黏附与侵袭实验。与野生株DE17(黏附：1.1×107CFU/孔;侵袭：1.4×104 CFU/孔)相比,DE17Δpf

关键词：禽致病性大肠杆菌甲硫氨酸代谢通路 LuxS/AI-2型密度感应系统 sahh基因 pfs基因

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