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spla2x降低棕榈酸脂毒性保护结肠细胞机制研究

sPLA2X降低棕榈酸脂毒性保护结肠细胞机制研究

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作者：陶琴琴南昌大学

学位级别：硕士

饮食中脂质是诱发炎性肠病(Inflammatory bowel diseases,IBD)的重要环境因素。脂质代谢产生脂毒性产物,可刺激机体产生促炎因子,破坏肠粘膜屏障,加重IBD的病程。s PLAx(基因pla2g10)是分泌型磷脂酶一员,对磷脂酰胆碱(PC)具有最高的催... 详细信息

饮食中脂质是诱发炎性肠病(Inflammatory bowel diseases,IBD)的重要环境因素。脂质代谢产生脂毒性产物,可刺激机体产生促炎因子,破坏肠粘膜屏障,加重IBD的病程。s PLAx(基因pla2g10)是分泌型磷脂酶一员,对磷脂酰胆碱(PC)具有最高的催化活性,可水解PC产生促炎介质(如溶血磷脂LPC、花生四烯酸AA)和抗炎介质(如ω3-PUFA),在炎症、哮喘和动脉粥样硬化等疾病中起着重要作用。实验室前期初步发现高脂饮食小鼠s PLAx上调,但其在高脂诱导的结肠上皮损伤中到底有何作用以及分子机制尚不明确。目的:通过动物模型研究高脂饮食对小鼠结肠的损伤,通过细胞模型研究棕榈酸(PA)对结肠细胞NCM460的影响。探讨s PLAx对PA诱导的结肠细胞炎症和细胞凋亡的生物学作用与分子机制。通过生物信息学分析和PA诱导前后脂质代谢物变化,分析s PLAx调控结肠细胞脂质代谢的作用。方法:1.将C57BL/6小鼠分为正常饮食组(NCD)和高脂饮食组(HFD),HFD组喂食60%的高脂饲料,NCD组喂食正常小鼠饲料,构建高脂模型24周。通过q-PCR和免疫荧光检测炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α、IL-23细胞粘附分子Ifng、巨噬细胞迁移抑制因子Cd74、趋化因子Cxcl13、脂肪酸代谢相关基因(Fabp2)和分泌型PLA(pla2g10,pla2g2a)的变化。2.将PA与正常结肠上皮NCM460孵育,构建体外高脂细胞模型。用不同浓度PA或溶剂处理NCM460,通过q-PCR检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α及pla2g10与pla2g2a表达变化。3.用PCR法从NCM460中克隆pla2g10基因,将pla2g10插入慢病毒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-PURO,构建PCDH-pla2g10过表达载体。导入HEK-293T进行慢病毒包装,收集病毒液感染结肠上皮细胞NCM460。用嘌呤霉素筛选阳性细胞,通过Western Blot和q-PCR检测s PLAx表达水平。4.将细胞分为空载组(PCDH)和s PLAx过表达组(PCDH),用不同浓度的PA或溶剂处理空载组和s PLAx过表达组细胞24 h。q-PCR和Western Blot检测炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的m RNA和蛋白表达水平,通过丙二醛试剂盒检测MDA的变化。5.从GEO数据库下载炎症性肠病患者和健康对照组的基因表达数据,通过Spearman分析溃疡性结肠炎发炎患者、未发炎患者及健康对照组中IL-6、IL-1β、TNF-α与pla2g10相关性。6.将PCDH和PCDH细胞铺96孔板,待细胞贴壁后,分别用0、100、200、300、400、500、600、700、800μM的PA处理细胞24 h,通过CCK8试剂检测过表达s PLAx后结肠细胞对PA损伤的抵抗。7.将PCDH和PCDH细胞铺6孔板,分别用300、400μM PA或溶剂处理两组细胞24 h,通过7ADD-PE凋亡试剂盒进行染色,流式细胞法检测s PLAx过表达对PA诱导的NCM460凋亡的影响。通过Western Blot和q-PCR检测凋亡过程中cleaved-Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白与基因表达情况。8.从GEO数据库下载炎症性肠病患者和健康对照组的基因表达数据,按pla2g10表达水平分为高表达组(PLA2G10)和低表达组(PLA2G10),通过GSEA分析溃疡性结肠炎患者中PLA2G10和PLA2G10中IL6-JAK-STAT3通路激活情况。用400μM PA处理PCDH和PCDH细胞24 h,通过Western Blot检测s PLAx过表达对PA处理后结肠细胞IL6-JAK-STAT3通路的影响。9.用脂质提取液提取上述两类细胞的脂质代谢物,使用氮吹仪吹干,通过超高效液相色谱联用质谱(UHPLC-MS)检测长链脂肪酸FA、溶血磷脂酰肌醇LPI、溶血卵磷脂LPC、二脂酰甘油DG等脂质代谢物变化。结果:1.在小鼠高脂模型中,与正常饮食小鼠结肠相比,高脂饮食小鼠结肠中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL23、细胞粘附分子Ifng,巨噬细胞迁移抑制因子Cd74和IFN-γ、TGF-β、Cxcl13表达都显著上升,而脂肪酸结合蛋白Fabp2表达显著下降,pla2g10在高脂饮食小鼠的结肠中显著上调。2.在细胞高脂模型中,高浓度PA诱导NCM460细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的m RNA表达水平上升,PA诱导后pla2g10表达显著升高。3.成功获得了重组PCDH-pla2g10载体,基因测序结果显示pla2g10序列正确。PCDH细胞的s PLAx蛋白和m RNA水平较空载组表达显著增加,表明s PLAx过表达NCM460细胞系构建成功。4.细胞实验表明,正常培养条件下过表达s PLAx对

关键词：分泌型磷脂酶 spla2x 结肠炎棕榈酸脂毒性溃疡性结肠炎

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