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分泌型磷脂酶A2的表达、纯化及对泡沫细胞胆固醇含量的影响

分泌型磷脂酶A2的表达、纯化及对泡沫细胞胆固醇含量的影响

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作者：陈春婷山西医科大学

学位级别：硕士

目的:人源分泌型磷脂酶A2(Human secreted phospholipase A2 GIIE,spla2-hGIIE)的表达、纯化,外源性添加spla2-hGIIE对泡沫细胞内胆固醇含量的影响。利用毕赤酵母重组表达系统表达人源spla2(Human secreted phospholipase A2GIB,spla2-hgib)和其酶原(spla2-Pro-hgib),并采用层析法纯化蛋白。方法:利用毕赤酵母表达系统表达纯化spla2-hGIIE、spla2-hgib,采用离子交换和分子排阻两步法纯化蛋白;构建巨噬细胞源性泡沫细胞模型;设计实验组和对照组,采用胆固醇测定试剂盒检测外源添加spla2-hGIIE蛋白对泡沫细胞内胆固醇含量的影响;利用荧光定量PCR法分析与泡沫细胞形成相关基因m RNA的表达情况。本研究分为spla2-hGIIE的表达纯化,泡沫细胞模型的构建,spla2-hGIIE对泡沫细胞胆固醇含量的影响,spla2-hgib表达载体的构建、spla2-hgib蛋白的表达纯化。(1)spla2-hGIIE的表达和纯化首先复苏冻存的菌株X33-spla2-hGIIE,并在固体平板上划线分离;采用BSM培养基进行放大培养;高速离心收集发酵上清液,并对其进行过滤、浓缩和稀释处理;采用阳离子交换法对样品进行初步纯化,用分子筛进行精细纯化;利用BSA法检测目的蛋白浓度,采用酶活检测试剂盒测定目的蛋白的酶活性。(2)泡沫细胞模型的构建采用不同浓度梯度的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)处理巨噬细胞,CCK-8试剂盒检测其对巨噬细胞存活率的影响;采用ox-LDL处理巨噬细胞不同时间周期(24h、36h、48h),油红O染色法分析细胞内的脂质含量和分布情况。(3)spla2-hGIIE对泡沫细胞胆固醇含量的影响使用不同浓度梯度的spla2-hGIIE处理巨噬细胞源性泡沫细胞,利用总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离胆固醇(Free cholesterol,FC)试剂盒检测细胞内胆固醇含量;再用油红O染色评估spla2-hGIIE抑制泡沫细胞形成的程度;最后用实时荧光定量PCR检测与胆固醇合成、酯化、水解和巨噬细胞脂质流入、流出相关基因的m RNA表达情况。(4)spla2-hgib表达载体的构建根据spla2-hgib核酸蛋白序列设计引物,采用聚合酶链式反应扩增目的基因,用质粒提取试剂盒提取质粒pGAPZαA,双酶切后将目的基因与质粒连接以构建重组载体。并用菌落PCR鉴定、测序验证,再转化到大肠杆菌Top10感受态细胞,提取重组质粒,使用线性化内切酶将重组质粒线性化后电转入酵母细胞X33。将电转后的菌液涂布于YPD固体培养基上。(5)spla2-hgib蛋白的表达纯化筛选并挑取阳性单克隆菌,分别利用YPD和BSM培养基扩大培养,高速离心收集上清液,并对其进行过滤、浓缩和稀释处理,用离子交换层析进行初步纯化,再用分子排阻层析进行精细纯化,利用BSA检测目的蛋白的浓度,最后用酶活试剂盒检测目的蛋白的酶活性。结果:1.CCK-8结果显示80mg/L ox-LDL对巨噬细胞的存活率无明显毒性作用,油红O染色发现80mg/L ox-LDL处理巨噬细胞24h后能稳定建立泡沫细胞模型。2.与造模组相比,外源性添加spla2-hGIIE后,巨噬细胞源性泡沫细胞内的总胆固醇和游离胆固醇都有不同程度的下降,其中添加75mg/m L spla2-hGIIE蛋白之后,巨噬细胞内的TC降低至40.9%,FC降低至41.1%。3.实时荧光定量PCR检测结果显示,实验组中与胆固醇合成相关基因HMGCS、与胆固醇酯化(ACAT-1)和水解(n CEH)的相关基因表达量下降,巨噬细胞表面脂质流入相关基因(CD36,SR-A)和脂质流出相关基因ABCG1表达下降。4.成功构建pGAPZαA-hgib、pGAPZαA-Pro-hgib重组载体。5.采用电转法成功构建X33-pGAPZαA-hgib、X33-pGAPZαA-Pro-hgib毕赤酵母表达菌种;采用分级培养法扩大培养。6.使用阳离子柱和分子筛两步纯化,获得的spla2-Pro-hgib蛋白浓度为0.233mg/m L,每升培养基能获得0.2mg左右的目的蛋白。spla2-hgib的阳离子柱初步纯化结果显示蛋白浓度过低,因此需要进一步优化spla2-hgib表达方案。结论:成功表达、纯化spla2-hGIIE蛋白,构建巨噬细胞源性泡沫细胞,外源性添加spla2-hGIIE后能降低细胞内的胆固醇含量。构建pGAPZαA-hgib、pGAPZαA-Pro-hgib重组载体,并利用毕赤酵母表达系统进行蛋白表达。

关键词： spla2 spla2-hGIIE 泡沫细胞 spla2-hgib spla2-Pro-hgib

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