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猪流行性腹泻病毒特异性siga抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

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福建农业学报 2023年第9期38卷 1017-1023页

作者：朱海侠兆丰华生物科技(福州)有限公司福建福州350014

【目的】快速了解猪群感染猪流行性腹泻病毒或免疫猪流行性腹泻病毒相关疫苗后猪群特异性siga抗体水平。【方法】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ZJ08株进行纯化,采用纯化的病毒作为包被抗原,以辣根过氧化物... 详细信息

【目的】快速了解猪群感染猪流行性腹泻病毒或免疫猪流行性腹泻病毒相关疫苗后猪群特异性siga抗体水平。【方法】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ZJ08株进行纯化,采用纯化的病毒作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的SC(Secretory component,SC)多克隆抗体为标记抗体,通过优化检测条件,建立乳汁中猪流行性腹泻病毒特异性siga抗体间接ELISA检测方法。【结果】成功建立了猪流行性腹泻病毒siga抗体检测方法。PEDV抗原的最佳包倍浓度为0.6μg·孔−1,样本最佳稀释比例为1∶5,作用时间1 h;SC标记抗体最适稀释比例为1∶100,作用时间1.5 h。建立的ELISA方法能够特异性检测样本中抗PEDV siga抗体,与PoRV(Porcine rotavirus,PoRV)、TGEV(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的阳性乳汁均无交叉反应;批内、批间重复试验的变异系数小于10%,具有良好的特异性和重复性。通过临床采集的乳汁样品测定发现,样本中PEDV IgA抗体阳性率达到98.1%,而采用针对特异性siga的抗体方法检测,其阳性率仅为69.2%,样本中IgA和siga抗体符合率仅为70.6%,提示仅仅依据PEDV IgA抗体水平并不能很好地反映猪群免疫该疫苗后特异性黏膜免疫的真实水平。【结论】建立的PEDV特异性siga抗体检测方法可为分析、评估猪群免疫PEDV疫苗后乳汁中特异siga抗体产生及猪群的保护情况提供可靠依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒间接ELISA siga抗体

适合早期诊断的非洲猪瘟siga抗体量子点免疫层析检测方法建立

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畜牧兽医学报 2023年第10期54卷 4311-4319页

作者：谢青云易玮婕李嘉豪白昀谢星袁厅张越冯余凡赵东明步志高刘斐冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 南京农业大学动物医学院单分子纳米生物学实验室南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种烈性猪传染病,其极高的传染性和发病率给养猪产业造成了巨大的经济损失。目前尚无安全有效的ASF疫苗,因此早期监测是防控ASF最重要的解决方案之一。建立敏感、快速的AS... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种烈性猪传染病,其极高的传染性和发病率给养猪产业造成了巨大的经济损失。目前尚无安全有效的ASF疫苗,因此早期监测是防控ASF最重要的解决方案之一。建立敏感、快速的ASF现场即时检验方法,对维护生猪产业繁荣具有重要意义。首先基于氨基和羧基的偶联反应制备量子点微球(quantum dot microsphere,QDM)偶联ASFV重组抗原蛋白p30的检测探针和QDM-兔抗鸡IgY质控探针;接着在检测线和质控线分别固定鼠抗猪IgA-Sc片段抗体和鸡IgY蛋白制备侧向流免疫试纸条;待检动物口腔液中的ASF siga抗体经QDM-p30捕获可被固定至T线。将ASFV阳性口腔液以2倍梯度稀释,检测该方法的灵敏度。通过检测其他几种常见猪病病毒验证该方法的特异性。通过检测ASFV阴性和阳性动物的口腔液临床样本评价该方法的临床诊断效能。该方法特异性好,与PRV、CSFV、PRRV不存在交叉反应;灵敏度高,最低检出稀释度可达1∶64;耗时短,可在20 min内完成检测;操作便捷,无需侵入式采样;检出时间早,人工感染最早可于感染后第6天检出。本研究开发了一种口腔液中ASF siga抗体的现场即时检验(point-of-care testing,POCT)量子点免疫试纸条,为ASFV的监测和防控提供了新的技术支持和补充。

关键词：非洲猪瘟 siga抗体量子点免疫试纸条现场即时检验

猪流行性腹泻病毒单克隆抗体制备、鉴定及siga抗体ELISA检测方法建立

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猪流行性腹泻病毒单克隆抗体制备、鉴定及sIgA抗体ELISA检测方法...

作者：温颖西北农林科技大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)属于冠状病毒科(Coronaviridae),α-冠状病毒属(Alphacoronavirus),是一种危害养猪业的重大传染病病原。PEDV感染后导致猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED),主要引起猪严重的腹泻、呕吐和脱水,造成哺乳仔猪极高的死亡率。2010年以来,在亚洲、北美和欧洲的养猪场出现了高毒力的PEDV变异毒株,导致全球养猪业遭受巨大经济损失。被动乳汁免疫是保障新生哺乳仔猪免遭PED等肠道疾病影响的最有效方式。乳汁中高滴度的分泌型Ig A(secretory Ig A,siga)抗体有助于降低哺乳仔猪的发病率和死亡率。本研究制备了针对PEDV的单克隆抗体并利用多种手段进行鉴定,进一步基于单克隆抗体捕获病毒抗原的方式建立了针对乳汁中PEDV siga抗体的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法。(1)PEDV单克隆抗体的制备本研究首先采用切向流超滤系统和凝胶过滤层析的方法纯化流行毒株PEDV CH/hubei/2016病毒粒子,将其作为免疫原免疫6～8周龄BALB/c小鼠。取血清抗体效价较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选融合后的杂交瘤细胞株,并对阳性细胞株进行连续亚克隆。本研究共获得10株稳定分泌PEDV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(2)PEDV单克隆抗体的鉴定本研究构建PEDV结构蛋白表达载体并进行重组表达,利用PEDV重组蛋白对单克隆抗体进行ELISA和免疫印迹试验(Western-blot)鉴定。经间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)和激光共聚焦扫描显微术(confocal laser scanning microscopy,CLSM)进一步验证单克隆抗体与病毒的反应性。结果显示,共获得4株PEDV纤突糖蛋白(spike protein,S)单克隆抗体和6株PEDV核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)单克隆抗体。通过小鼠体内诱生法制备腹水,抗体的IPMA效价在2.56×10至1.024×10之间。IFA结果表明4株单克隆抗体可特异性识别PEDV感染的非洲绿猴肾上皮Vero细胞。CLSM发现,针对S蛋白的单克隆抗体可以指示PEDV感染Vero细胞过程中病毒新合成S蛋白的亚细胞定位。(3)PEDV siga抗体ELISA检测方法的建立本研究以单克隆抗体捕获病毒抗原的方式,建立检测猪临床乳汁样本中PEDV siga抗体ELISA方法。重复性试验结果显示该方法变异系数在4.0%～8.1%之间,重复性较好。临床阳性乳汁样品稀释1280倍,ELISA仍可检测出阳性,敏感性较高。使用本试验方法与商品化试剂盒共同检测临床样品,结果显示具有较高的一致性。综上所述,本研究成功制备了10株PEDV特异性单克隆抗体,并利用多种手段对单克隆抗体进行鉴定,为后续PEDV感染机制和临床检测提供了重要的分子基础。本研究进一步基于单克隆抗体捕获病毒抗原方式建立了PEDV siga抗体ELISA检测方法,为PEDV疫苗免疫评估提供了有力工具。

关键词：猪流行性腹泻病毒单克隆抗体 siga抗体乳汁免疫酶联免疫吸附试验

猪流感H3N2型病毒特异性siga抗体分泌规律研究

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中国人兽共患病学报 2017年第11期33卷 956-961页

作者：白昀舒采松甘源倪博华利忠吴猛邵国青冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014 省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室南京210014 南京农业大学南京210095

目的研究不同品种猪应答猪流感病毒感染,呼吸道分泌特异性siga抗体的分泌规律,以及针对不同抗原蛋白siga抗体的分泌差异。方法将猪流感病毒A/swine/Nanjing/51/2010(H3N2)滴鼻感染试验猪(1×10~7 TCID50/mL,2mL/头),采集感染后21d内不... 详细信息

目的研究不同品种猪应答猪流感病毒感染,呼吸道分泌特异性siga抗体的分泌规律,以及针对不同抗原蛋白siga抗体的分泌差异。方法将猪流感病毒A/swine/Nanjing/51/2010(H3N2)滴鼻感染试验猪(1×10~7 TCID50/mL,2mL/头),采集感染后21d内不同时间点的鼻拭子样品,用M1、NS1和PB1三种重组蛋白分别建立的间接ELISA方法检测特异性siga抗体,并分析其分泌规律及差异。结果显示针对3种重组蛋白的特异性siga抗体在整个检测周期内,分泌规律相似,差异无统计学意义,均表现为感染后第5d特异性siga抗体水平迅速升高,第14d达到高峰,随后开始逐渐下降。在不同品种猪之间,仅巴马猪分泌抗PB1蛋白的siga抗体在第14d和21d时高于二元猪(Psiga抗体在两种品种猪之间无统计学差异(P>0.05)。结论初步探索了猪在感染猪流感病毒后特异性siga黏膜抗体的分泌规律,为进一步研究SIV黏膜抗体诊断试剂奠定基础。

关键词：猪流感病毒间接ELISA siga抗体

ELISA法快速检测菌痢病人粪抗体siga的研究

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浙江预防医学 1997年第2期9卷 58-60页

作者：梅玲玲莫顺堂陈秀英顾金华浙江省卫生防疫站 310009 湖州市第二人民医院

细菌性痢疾是我国主要肠道传染病之一,年发病人数高达300万以上。一直以来,菌痢实验室诊断方法主要依靠细菌培养,但细菌培养的阳性率低,报告结果时间长(一般2~4天),给防治工作带来一定困难。本实验以ELISA法为检测手段,应用痢菌混合LPS... 详细信息

细菌性痢疾是我国主要肠道传染病之一,年发病人数高达300万以上。一直以来,菌痢实验室诊断方法主要依靠细菌培养,但细菌培养的阳性率低,报告结果时间长(一般2~4天),给防治工作带来一定困难。本实验以ELISA法为检测手段,应用痢菌混合LPS为抗原,快速检测菌痢病人粪便中的特异性siga抗体,获得了较为理想的结果。材料与方法一、材料1．菌株:福氏志贺氏菌Y变种由上海市卫生防疫站菌种室赠送。宋内氏志贺氏菌、大肠杆菌菌株由本站菌种室保存。2．检测标本:主要来自杭州、湖州、嘉兴等市各大医院。其中细菌培养阳性菌痢病人大便69份;霍乱病人大便70份;轮状病毒阳性病人大便23份;脊灰病毒阳性病人大便22份;伤寒病人大便16份;正常人大便176份。采样时将病人新鲜排出的粪便置灭菌试管内,加橡皮塞,-20℃低温冰箱保存。

关键词：细菌性痢疾 siga抗体抗体检验 ELISA

抗禽流感病毒H5N1分泌型IgA在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

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生物工程学报 2011年第2期27卷 219-225页

作者：李存张宝中安小平米志强刘大斌姜焕焕潘博王盛陈斌黄芬王娟王晓娜童贻刚军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

分泌型IgA(siga)在机体的粘膜免疫中具有重要作用,在外分泌道中比单体IgA和IgG抗体具有更好的抗感染活性。为了表达抗禽流感病毒H5N1人-鼠嵌合分泌型IgA抗体,首先以本室先前构建的稳定表达IgA的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞系为基础,共转... 详细信息

分泌型IgA(siga)在机体的粘膜免疫中具有重要作用,在外分泌道中比单体IgA和IgG抗体具有更好的抗感染活性。为了表达抗禽流感病毒H5N1人-鼠嵌合分泌型IgA抗体,首先以本室先前构建的稳定表达IgA的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞系为基础,共转染分泌片和J链表达质粒,然后用抗生素Zeocin选择阳性克隆细胞,利用倍比稀释的方法筛选分泌siga的单克隆细胞,通过Western blotting分析培养上清中siga的表达情况。结果表明,在CHO细胞中成功表达了siga抗体,上述研究为研制分泌型IgA抗体制剂奠定了良好的基础。

关键词：禽流感病毒H5N1 Western blotting siga抗体

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基因疫苗预防牙周炎的实验研究

中华口腔医学杂志 2005年第4期40卷 310-313页

作者：张凤秋杨连甲吴织芬第四军医大学口腔医学院牙周科第四军医大学口腔医学院口腔病理学教研室西安710032

目的将已构建的P.gingivaliskgpcd基因的真核重组表达质粒pcDNA3.1+/kgpcd作为基因疫苗,免疫SD大鼠并观察其在预防牙周炎中的作用。方法pcDNA3.1+/kgpcd经颌下腺靶向注射免疫SD大鼠,采用间接ELISA法检测唾液中特异性抗体的水平,并经组... 详细信息

目的将已构建的P.gingivaliskgpcd基因的真核重组表达质粒pcDNA3.1+/kgpcd作为基因疫苗,免疫SD大鼠并观察其在预防牙周炎中的作用。方法pcDNA3.1+/kgpcd经颌下腺靶向注射免疫SD大鼠,采用间接ELISA法检测唾液中特异性抗体的水平,并经组织化学染色观察免疫对SD大鼠牙周炎的保护情况。结果重组质粒pcDNA3.1+/kgpcd经颌下腺靶向注射免疫SD大鼠,可诱导机体产生高水平的唾液中抗KGPcdsiga抗体,显著高于对照组,并且实验组牙槽骨的破坏程度显著低于对照组。结论颌下腺靶向注射免疫可引起有效的黏膜免疫应答,KGPcd作为有效的免疫原产生的抗体对P.gingivali引起的牙周炎可起到保护作用。

关键词：牙周炎实验研究疫苗预防 pcDNA3 ELISA法检测 SD大鼠重组表达质粒注射免疫 siga抗体黏膜免疫应答特异性抗体颌下腺基因疫苗 cd基因染色观察组织化学重组质粒保护作用对照组靶向高水平牙槽骨实验组免疫原

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2021年猪流行性腹泻检测分析与防控建议

猪业科学 2022年第3期39卷 73-76页

作者：李相钊朱绍伟李秀娟周忠涛张广陈方园齐鲁动物保健品有限公司山东济南250100 滕州市畜牧渔业事业发展中心山东枣庄277599 碧迪医疗器械(上海)有限公司上海200131

2021年对全国269个猪场样本进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测,其中抗原检出率为42.9%,比2020年检出率有所提高,反映了该病防控依然问题多多;而siga抗体合格率为58.7%,IgG抗体合格率为52.5%,siga抗体合格率略高一些,但抗体整体趋势基本一... 详细信息

2021年对全国269个猪场样本进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测,其中抗原检出率为42.9%,比2020年检出率有所提高,反映了该病防控依然问题多多;而siga抗体合格率为58.7%,IgG抗体合格率为52.5%,siga抗体合格率略高一些,但抗体整体趋势基本一致,从抗体角度也印证了对该病的防控还有很大的上升空间。

关键词：猪流行性腹泻分析与防控 IgG抗体合格率猪场 siga抗体检出率

以α甘露聚糖肽为佐剂的EV71全病毒灭活抗原黏膜免疫小鼠的抗体应答

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基础医学与临床 2013年第11期33卷 1435-1439页

作者：荆晶孙强冯素玲赵兴华廖怡然王冰黎卫平兰州大学基础医学院病理研究所甘肃兰州730000 陕西省新型治疗性疫苗工程技术研究中心陕西西安710061

目的肠道71型全病毒灭活抗原（EV71Ag）联合α-甘露聚糖肽（PA）佐剂滴鼻免疫，观察全身免疫应答及持续时间。方法5—6周龄BALB／c雌性小鼠随机分为阴性对照组，阳性对照组，高剂量疫苗组，低剂量疫苗佐剂组和高剂量疫苗佐剂组，每组10... 详细信息

目的肠道71型全病毒灭活抗原（EV71Ag）联合α-甘露聚糖肽（PA）佐剂滴鼻免疫，观察全身免疫应答及持续时间。方法5—6周龄BALB／c雌性小鼠随机分为阴性对照组，阳性对照组，高剂量疫苗组，低剂量疫苗佐剂组和高剂量疫苗佐剂组，每组10只。阴性对照组以PBS滴鼻，阳性对照组以EV71Ag肌注给药，免疫组以EV71Ag单独和不同剂量分别配伍PA滴鼻给药。首次给药后第0、2、3、4、5和6周采集血清及鼻肺灌洗液，ELISA法检测血清特异性IgG抗体水平及鼻肺灌洗液siga抗体水平，MTr法检测淋巴细胞增殖，中和抗体实验检测小鼠血清中和抗体水平。结果各滴鼻组小鼠血清中均产生一定水平的特异性IgG抗体，高剂量疫苗佐剂组第三次免疫后其血清IgG（2．477±0．500）可达到阳性对照组（3．040±0．120）的80％，佐剂组体外淋巴细胞增殖率较阳性对照组有显著增高（P〈0．05），各滴鼻组血清中和抗体滴度均〉8。结论EV71全病毒灭活联合仪．甘露聚糖肽佐剂免疫小鼠可诱导全身免疫应答，且α-甘露聚糖肽佐剂可增强其作用。

关键词：黏膜免疫 EV71 中和抗体特异性IgG抗体 siga抗体淋巴细胞增殖率