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表达PEDV s蛋白重组PRV的构建与生物学特性评价

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中国兽医学报 2024年第4期44卷 657-663页

作者：侯晓璇穆永王同燕颜世君王孟月谭菲菲田克恭河南农业大学动物医学学院河南郑州450046 国家兽用药品工程技术研究中心河南洛阳471000 普莱柯生物工程股份有限公司河南洛阳471000

将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株的s胞外区基因克隆至含有gG基因上、下游同源臂以及抗性筛选基因的转移质粒pUC-ABK中,构建供体质粒pUC-ABK-s,获得线性同源重组片段As-K-B。利用Red同源重组技术将线... 详细信息

将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株的s胞外区基因克隆至含有gG基因上、下游同源臂以及抗性筛选基因的转移质粒pUC-ABK中,构建供体质粒pUC-ABK-s,获得线性同源重组片段As-K-B。利用Red同源重组技术将线性同源重组片段电转化至含有pPRVBac-GFPTK-gE-gI-11k-28k-的感受态中获得重组pPRVBac-s,最后拯救获得重组病毒rPRV-s。PCR及IFA鉴定结果显示,s胞外区基因成功转录且表达,生物学特性评价结果表明重组病毒能够稳定遗传,为研制猪流行性腹泻病毒活载体疫苗提供了思路。

关键词： PEDV s蛋白 Red同源重组重组PRV

泉州市2022-2023年新冠病毒Omicron变异株基因组特征及s蛋白突变位点动态分析

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病毒学报 2024年第1期40卷 97-105页

作者：陈晓玲郑丹凤龚彩婷陈韵妍郑友限林满芳陈霖霖王伟明福建医科大学附属泉州市疾病预防控制中心泉州362000 福建医科大学公共卫生学院福州350122 泉州市疾病预防控制中心泉州362000

本研究旨在了解泉州市新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,sARs-CoV-2)流行株的基因型别分布及全基因组特征,动态研究s蛋白关键结构域的突变规律。采用纳米孔测序获取2022年3月至2023年6月泉州市新冠病毒监... 详细信息

本研究旨在了解泉州市新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,sARs-CoV-2)流行株的基因型别分布及全基因组特征,动态研究s蛋白关键结构域的突变规律。采用纳米孔测序获取2022年3月至2023年6月泉州市新冠病毒监测病例毒株的全基因组序列,对数据过滤后的641条优质序列进行基因型别鉴定、序列比对及突变位点统计,通过聚类热图动态分析s蛋白关键结构域的氨基酸突变规律,借助VarEPs系统完成变异对病毒传播和适应性影响评估。监测期间泉州地区流行株均为Omicron变异株,总体呈BA.2-BA.5-XBB谱系顺序更替,与同期全国流行趋势基本一致;核苷酸与氨基酸突变位点数分别为81个(79~84个)、57个(55~62个)且逐步增加;s蛋白RBM区有氨基酸变异更替现象,如G446V到G446s、T478K到T478R/N、F486I/V到F486s/P;近期在非BA.2.75流行期间频繁检出BA.2.75于NTD区的高频突变位点,如W152R、F157L、I210V且有上升趋势;不同时期在Furin裂解点或s2亚基区可检出不同的氨基酸突变,与同期流行株基因型别更替相关。这些氨基酸突变均可一定程度上降低s蛋白与中和抗体的稳定性,但对其与ACE2的结合状态改变不大,多为中性突变。从基因层面开展新冠病毒变异动态监测,可以帮助我们掌握区域基因型别特征及病毒变异进化规律,探索变异对病毒传播和适应性影响,及时预警关键变异。

关键词：新型冠状病毒奥密克戎 s蛋白氨基酸突变聚类热图

猪流行性腹泻病毒s蛋白外分泌信号肽筛选及稳定表达细胞系的构建

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中国兽医科学 2024年第7期 873-880页

作者：王传红宋旭刘诗雨张格格徐红王祎赵永祥郭荣利范宝超胡朝阳李彬江苏大学生命科学学院江苏省农业科学院兽医研究所

为了优化在真核细胞中猪流行性腹泻病毒（PEDV）s蛋白的分泌表达，且构建稳定表达的细胞系，本研究设计合成了9个信号肽引物，通过同源重组的方式得到表达PEDV变异株AH2012/12株s全长蛋白的9个重组表达质粒，瞬时转染HEK 293T细胞后，通... 详细信息

为了优化在真核细胞中猪流行性腹泻病毒（PEDV）s蛋白的分泌表达，且构建稳定表达的细胞系，本研究设计合成了9个信号肽引物，通过同源重组的方式得到表达PEDV变异株AH2012/12株s全长蛋白的9个重组表达质粒，瞬时转染HEK 293T细胞后，通过Western-blot验证蛋白外分泌表达水平，结果显示，筛选出的含跨膜蛋白酶丝氨酸信号肽的s蛋白具有较好的外分泌表达特性；利用G418筛选，获得稳定表达PEDV s蛋白的单克隆细胞，通过传代验证不同代次的蛋白表达水平，成功构建了可稳定外分泌表达PEDV s的CHO细胞系。结果显示，可在100 m L CHO-PEDV/s细胞培养上清中获得约5 mg的PEDV s蛋白，提高了PEDV s蛋白的表达和分泌，为进一步研制PEDV亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 s蛋白信号肽稳定表达亚单位疫苗

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牛冠状病毒s和HE蛋白研究进展

中国畜牧兽医 2024年第7期51卷 3118-3127页

作者：靳双媛杜家伟王雪妍郭雪莲许立华宁夏大学动物科技学院银川750021

牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起新生犊牛腹泻、牛的呼吸道感染和成年牛冬痢的一种病原,主要通过粪-口感染和呼吸道气溶胶传播。研究表明,BCoV在亚临床感染的成年牛体内可持续存在,这可能是BCoV在牛群中广泛存在且能长期循... 详细信息

牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起新生犊牛腹泻、牛的呼吸道感染和成年牛冬痢的一种病原,主要通过粪-口感染和呼吸道气溶胶传播。研究表明,BCoV在亚临床感染的成年牛体内可持续存在,这可能是BCoV在牛群中广泛存在且能长期循环的原因。因此,BCoV的流行会对集约化牛场造成巨大的经济损失,BCoV的防控形势极其严峻。BCoV s蛋白包含主要的抗原位点,可与宿主表面的唾液酸(sA)结合,且s蛋白参与病毒与宿主细胞的吸附和膜融合过程,能促进宿主产生有效的中和抗体。BCoV HE蛋白具有乙酰酯酶活性和血凝活性,能与s蛋白协同附着于细胞表面并启动感染。s和HE蛋白均在病毒的组织或宿主嗜性及毒力等方面发挥重要作用,这些作用也为进一步开展BCoV病原研究及后续疫苗和药物的研制提供参考。笔者重点阐述了BCoV s和HE蛋白的分子结构及功能,以及BCoV基于s和HE蛋白的受体识别作用(包括利用N-乙酰-9-O-乙酰神经氨酸为糖结合受体,利用人类白细胞抗原Ⅰ类分子为蛋白结合受体)。受体识别是冠状病毒感染和致病的重要决定因素,也是宿主免疫监视和人类干预策略最重要的靶标之一。因此,充分了解BCoV s和HE蛋白的结构功能和受体识别作用对于了解病毒的致病机制及抗病毒药物、疫苗的研发具有重要意义。

关键词：牛冠状病毒(BCoV) s蛋白 HE蛋白受体识别

sARs-CoV-2 s蛋白引起呼吸道上皮细胞炎症反应的研究进展

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中国感染控制杂志 2024年第1期23卷 112-118页

作者：刘兴健张华华张锐钢广东医科大学基础医学院生理学教研室广东湛江524023 广东医科大学基础医学院生物学教研室广东湛江524023

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(sARs-CoV-2)感染引起的肺炎对人类生命健康产生威胁,对社会经济造成巨大损失。病毒的结构蛋白刺突蛋白(s蛋白)一直被认为主要介导病毒侵入宿主细胞。s蛋白可独立于病毒引起多种细胞产生炎症反应,因此,了... 详细信息

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(sARs-CoV-2)感染引起的肺炎对人类生命健康产生威胁,对社会经济造成巨大损失。病毒的结构蛋白刺突蛋白(s蛋白)一直被认为主要介导病毒侵入宿主细胞。s蛋白可独立于病毒引起多种细胞产生炎症反应,因此,了解s蛋白本身对呼吸道的影响能够为防治新型冠状病毒感染提供新视角。本文对sARs-CoV-2结构蛋白s蛋白引起呼吸道上皮细胞炎症反应的可能机制、临床表现等方面的研究进展进行了梳理,以期为疾病的预防和治疗提供参考。

关键词： sARs-CoV-2 s蛋白 ACE2 呼吸道炎症

猪流行性腹泻病毒s蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 181-187页

作者：邱永辉周建卫王潇宇周琳怡侯磊戴贝凝冯旭飞刘爵福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福州350028 扬州大学兽医学院扬州225000

本研究以猪流行性腹泻病毒(PEDV)全基因组为模板,利用RT-PCR方法扩增PEDV s基因的亲水区,将其克隆至pMAl-c2E原核表达载体,获得重组质粒pMAl-c2E-PEDV-s。经EcoRⅠ/salⅠ双酶切测序鉴定后,转化BL21菌,经IPTG诱导,成功表达了约74 kDa的... 详细信息

本研究以猪流行性腹泻病毒(PEDV)全基因组为模板,利用RT-PCR方法扩增PEDV s基因的亲水区,将其克隆至pMAl-c2E原核表达载体,获得重组质粒pMAl-c2E-PEDV-s。经EcoRⅠ/salⅠ双酶切测序鉴定后,转化BL21菌,经IPTG诱导,成功表达了约74 kDa的重组蛋白MBP-PEDV-s,亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白免疫3只健康的6~8周龄雌性BALB/c小鼠,将小鼠脾脏B淋巴细胞与sP2/0瘤细胞融合,采用间接ELIsA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,获得了4株能稳定分泌抗PEDV s蛋白抗体的杂交瘤细胞株1B11、1B10、1C8、3L3,其腹水效价都高于1∶100000。获得的4株单克隆抗体与PEDV经IFA和Western blot检测,结果显示均具有良好的反应性。而且3株单克隆抗体重链为IgG2a,1株重链为IgG2b;3株轻链为Kappa,1株轻链为Lambda。本研究表达了PEDV s蛋白并制备了单克隆抗体,为研究s蛋白的结构和功能提供了条件,为揭示PEDV致病机制奠定了基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 s蛋白原核表达单克隆抗体

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Omicron病毒s蛋白序列特征分析

扬州职业大学学报 2024年第1期28卷 40-43页

作者：金会会孙业富郭俊荣扬州职业大学江苏扬州225009

采用生信方法,从理化性质、亲疏水性、跨膜区域、信号肽特征、磷酸化位点以及最佳抗原表位,分析Omicron变异株蛋白序列特征并预测其抗体结合位点。结果表明,该变异株s蛋白理论等电点为7.14,亲水性总平均值为-0.080,为低亲水性分泌蛋白,... 详细信息

采用生信方法,从理化性质、亲疏水性、跨膜区域、信号肽特征、磷酸化位点以及最佳抗原表位,分析Omicron变异株蛋白序列特征并预测其抗体结合位点。结果表明,该变异株s蛋白理论等电点为7.14,亲水性总平均值为-0.080,为低亲水性分泌蛋白,存在128个磷酸化位点,主要的二级结构类型为无规卷曲,抗原表位区域在614~629、770~776范围,获得该病毒s蛋白关键抗体结合位点。

关键词： s蛋白序列特征 Omicron病毒

靶向新型冠状病毒s蛋白的侵入抑制剂研究进展

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药学进展 2024年第5期48卷 335-349页

作者：高恒胡立德张继伟贾惠婻展鹏刘新泳山东大学药学院药物化学研究所化学生物学教育部重点实验室山东济南250012

由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(sARs-CoV-2)引发的新型冠状病毒感染(COVID-19)给人类生命健康和社会经济发展造成了极为严重的影响。随着病毒的持续变异,现有疫苗和治疗药物效果下降,公共卫生风险仍然存在。因此,亟需开发针对新... 详细信息

由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(sARs-CoV-2)引发的新型冠状病毒感染(COVID-19)给人类生命健康和社会经济发展造成了极为严重的影响。随着病毒的持续变异,现有疫苗和治疗药物效果下降,公共卫生风险仍然存在。因此,亟需开发针对新突变株的新靶点和新机制的药物。s蛋白是sARs-CoV-2重要的表面蛋白,其介导着病毒侵入宿主细胞这一关键步骤,是抗新型冠状病毒入侵的理想靶点。通过对近年来s蛋白抑制剂的研究实例进行分析,对该领域取得的进展进行总结,旨在为抗sARs-CoV-2药物的研发提供参考。

关键词：严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型抗病毒药物 s蛋白抑制剂耐药

猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELIsA检测方法的建立和初步应用

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中国兽医科学 2024年

作者：王婉莹石正旺罗俊聪廖焕程冯露郑海学田宏蔺国珍中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室西北民族大学生命科学与工程学院

为检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）IgA抗体，以PEDV重组s蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶标记的小鼠抗猪IgA单克隆抗体为检测抗体，建立并优化了PEDV IgA抗体的ELIsA检测方法，并评估了其特异性、敏感性、重复性及临床样品检测性能。结... 详细信息

为检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）IgA抗体，以PEDV重组s蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶标记的小鼠抗猪IgA单克隆抗体为检测抗体，建立并优化了PEDV IgA抗体的ELIsA检测方法，并评估了其特异性、敏感性、重复性及临床样品检测性能。结果显示：该方法抗原最佳包被质量浓度为2 μg/mL，酶标抗体的最佳工作浓度为1︰25 000，血清最佳稀释度为1︰50；与猪伪狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、塞内卡病毒、口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应；灵敏度为1︰800；批内、批间变异系数均小于10%；与IDEXX商品化试剂盒具有高度一致性。结果证明，本研究中建立的PEDV IgA抗体检测方法特异性强、敏感性高、重复性好，适用于猪流行性腹泻的临床诊断与防控、流行病学调查以及免疫效果评估。

关键词：猪流行性腹泻病毒 s蛋白 IgA抗体 ELIsA