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Establishment of novel embryonic stem(ES) cell lines from OG2/rtta blastocysts

Journal of Genetics and Genomics 2011年第7期38卷 289-295页

作者： Hui Yao Yonghua Jiang YU Zhang Wenqiang Liu Bo Huang Xiaodong Wang Shaorong Gao College of Life Science Beijing Normal University Beijing 100875 China National Institute of Biological Sciences NIBS Beijing 102206 China

Embryonic stem （ES） cells derived from the pre-implantation blastocyst-stage embryos have been widely used to investigate the molecular events determining pluripotency and cell lineage differentiation. As the first discovered ES-specific transcription factor, Oct4 has been considered as the core pluripotency factor of ES cells. In the present study, we successfully established seven ES lines from the blastocysts collected from female OG2 （Oct4-GFP transgenic） mice, which have been crossed with male rtta transgenic mice. The pluripotency of the ES cell lines can be visualized by the expression of Oct4-GFP under fluorescent microscopy and germ-line transmission capability has been further confirmed. More importantly, the presence of rtta could induce transgene＇s expression with the help of doxycycline. Therefore, these ES cell lines provide an excellent tool to further discover novel factors affecting pluripotency and to investigate the molecular mechanism of reprogramming in defined transcription factors mediated nuclear reprogramming.

关键词： Embryonic stem (ES) cells Oct4 rtta

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脑部特异表达rtta调控元件转基因小鼠的构建

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2008年第1期29卷 16-19页

作者：章蓉孙强徐桂芳董娟金宇娟江楠华东师范大学脑功能基因组学研究所上海200062

为获得一种可调控基因表达系统,避免传统转基因在胚胎发育早期表达的毒性作用或致死作用以及基因过度表达而造成难于分析的复杂多表型,应用分子生物学方法将四环素反式激活子rtta克隆到仅在脑部能被激活的钙调蛋白依赖性蛋白激酶CaM kin... 详细信息

为获得一种可调控基因表达系统,避免传统转基因在胚胎发育早期表达的毒性作用或致死作用以及基因过度表达而造成难于分析的复杂多表型,应用分子生物学方法将四环素反式激活子rtta克隆到仅在脑部能被激活的钙调蛋白依赖性蛋白激酶CaM kinaseⅡα亚基启动子之后,将其通过显微注射方法注入FVB小鼠受精卵雄原核中获得四环素调控系统中反应组分的转基因工具鼠。经PCR及Southern检测,最终得到3只阳性小鼠(1公2母),表达检测结果显示,其中仅2只(1公1母)后代检测到rtta表达产物。结果表明已成功构建四环素调控系统中的转基因工具鼠,为今后研究其他脑部基因功能提供便利。

关键词：小鼠转基因 rtta CaM kinaseⅡ

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脑区特异性表达rtta转基因鼠的构建及初步应用

脑区特异性表达rtTA转基因鼠的构建及初步应用

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作者：章蓉扬州大学

学位级别：硕士

调控转基因在发育的特定阶段和特定组织中进行表达可以更加精确的研究某一基因产物的功能,同时这种可调控性既可以避免传统不可调控转基因在胚胎发育中早期表达的毒性作用或致死作用而阻碍对表型的分析,又可以避免基因过度表达而造成难... 详细信息

调控转基因在发育的特定阶段和特定组织中进行表达可以更加精确的研究某一基因产物的功能,同时这种可调控性既可以避免传统不可调控转基因在胚胎发育中早期表达的毒性作用或致死作用而阻碍对表型的分析,又可以避免基因过度表达而造成难于分析的复杂的多表型。四环素调控系统由于可以严密高效的调控转基因的表达,而从众多的调控系统中脱颖而出,被广泛应用于各个生物学领域,并已成功应用于人工调控转基因小鼠中外源基因的表达。本研究即是应用四环素调控系统中的Tet-on系统,将其反式激活子rtta用分子生物学方法克隆到仅在前脑特异性表达的钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM kinase IIalpha)α亚基启动子序列之后,构建p279-rtta重组质粒。通过对FVB小鼠受精胚胎的雄原核显微注射,获得阳性转基因小鼠,以此构建脑区特异性表达rtta的工具小鼠模型。此小鼠模型建立之后,与本室已构建的pTRE-SV40Tag转基因小鼠,即Tet-on系统中反应组分转基因小鼠杂交,得到双阳性转基因小鼠经强力霉素诱导检测SV40Tag在前脑表达情况,由此来验证该模型工具鼠的诱导效率。实验中注射移植后出生原代小鼠179只,经PCR和Southern检测得到p279-rtta阳性小鼠3只(1♂2♀)。F1代阳性小鼠脑组织中检测到rtta的表达,其它脏器中未检测到。通过饮水添加Dox(2mg/ml)及5%蔗糖进行诱导的杂交双阳性小鼠脑及各脏器组织中未检测到SV40Tag的表达。实验结果显示,此四环素调控组分的转基因工具鼠的构建是成功的,它可以为将来细致研究其他脑瘤相关基因的功能及基因治疗的研究提供便利。

关键词： rtta 钙调蛋白依赖性蛋白激酶强力霉素 SV40Tag

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基于纳米孔的四环素检测技术的研究

基于纳米孔的四环素检测技术的研究

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作者：张月川电子科技大学

学位级别：硕士

四环素作为抗生素家族中的一员被广泛应用在人类和动物医学中。抗生素类药物的广泛应用带来了诸多的环境问题。例如,残留在环境中的抗生素能够渗透到土壤和水源中,不仅能够引起超级细菌的发展,也能够对人类的健康产生许多未知的影响。现... 详细信息

四环素作为抗生素家族中的一员被广泛应用在人类和动物医学中。抗生素类药物的广泛应用带来了诸多的环境问题。例如,残留在环境中的抗生素能够渗透到土壤和水源中,不仅能够引起超级细菌的发展,也能够对人类的健康产生许多未知的影响。现在,对抗生素类物质的检测主要有以下几种:酶联免疫吸附测定法、液相色谱法(LC)、表面等离子体共振生物传感器、液相色谱-串联质谱法(LCMS/MS)。但是这些方法的一些缺点,如,成本高、测试时间长以及需要对样品进行预处理等阻碍了他们真正的走向应用。因此找到一种低廉、高效、的方法意义重大。人们对纳米孔传感器的研究从库尔特计数器的发明就已经开始,距今已经有几十年的时间了。随着纳米技术的发展,以纳米孔为基础的分子分析技术越来越受到人们的青睐。纳米孔传感器能够在单分子层面对生物分子进行检测,不仅不需要对样品进行分子标记,而且也更加直接灵敏。纳米孔传感器的发展经历了两个阶段:生物纳米孔传感器和固态纳米孔传感器。这两种类型的传感器都有各自的优点和缺点,如:生物纳米孔直径很小拥有较高的空间分辨率,但是纳米孔的尺寸很难调节。固态纳米孔的尺寸比较好调节,但是空间分辨率却相对较低。纳米孔通常是在氮化硅或二氧化硅薄膜上制备,通常采用聚焦离子束(FIB)、透射电子显微镜(TEM)或电介质击穿方法制得。纳米孔传感器因其独特的特性通常被用来检测核苷酸聚合物的形态、DNA序列、离子、生物小分子等。在这篇文章之中,我们用纳米孔技术与生物机制相结合的方法对四环素浓度进行了检测。反向四环素反式激活因子(rtta)和四环素反应元件(TRE)在四环素的作用下会相互结合并生成一个复合体。当这个复合体通过纳米孔时就会产生阻塞电流信号。通过对阻塞电流信号的检测就能够分辨出rtta、TRE和这个复合体。我们用了两种不同的方法对这些生物分子进行检测,一个是凝胶电泳,另一个是纳米孔生物传感器。在凝胶电泳试验中,我们成功的分辨出了rtta、TRE以及它们之间存在的弱相互作用。在纳米孔实验中,首先,我们用电击穿法在10nm氮化硅薄膜上制备了10nm以下的纳米孔,然后我们对rtta和TRE进行了检测,并且成功的将他们区别出来。之后,我们在不同浓度的Tet下探测了rtta和TRE的相互作用,并且成功将他们之间的结合过程表示了出来。与凝胶电泳相比,纳米孔传感器能够在单分子层面上对生物分子进行探测,更直接、更清晰、更灵敏。

关键词： rtta TRE 四环素纳米孔单分子探测

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