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rpod和gyrA基因对气单胞菌鉴定的比较分析

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疾病监测 2016年第3期31卷 200-204页

作者：李欣悦李凤娟杜鹏程王瑞白王多春中国疾病预防控制中心传染病预防控制所北京102206 河南省疾病预防控制中心河南郑州450016 北京市地坛医院北京100011

目的使用rpo D和gyr A基因对气单胞菌进行种水平的鉴定,比较两者分类结果的差异,同时对本研究中187株气单胞菌进行较为准确的种水平的分类。方法对生化鉴定的187株气单胞菌进行rpo D和gyr A基因聚合酶链反应扩增并测序,将序列与种特异... 详细信息

目的使用rpo D和gyr A基因对气单胞菌进行种水平的鉴定,比较两者分类结果的差异,同时对本研究中187株气单胞菌进行较为准确的种水平的分类。方法对生化鉴定的187株气单胞菌进行rpo D和gyr A基因聚合酶链反应扩增并测序,将序列与种特异的参考序列一起构建系统发育树。结果 187株菌经rpo D基因鉴定为7个种,经gyr A基因鉴定为9个种,还有一个未定种。两者鉴定最多的3个种一致,即维氏气单胞菌温和生物变种、豚鼠气单胞菌和水族馆气单胞菌。gyr A基因鉴定增加的2个种是异嗜糖气单胞菌和简氏气单胞菌。rpo D和gyr A基因对气单胞菌鉴定一致的有174株(93%),但有13株菌(7%)两者鉴定不一致。结论 rpo D和gyr A基因能够对大部分气单胞菌进行准确一致的分类,对于两者鉴定不一致的菌株,应增加管家基因进行分析。

关键词：气单胞菌 rpod基因 gyrA基因鉴定

食品与环境中豚鼠气单胞菌系统发育分析以及毒力和耐药性研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2020年第2期40卷 91-97页

作者：孔凡旭郝民王恒伟田甜邵希凤宋衍燕内蒙古科技大学包头医学院公共卫生学院 014040 北京市朝阳区疾病预防控制中心 100021

目的食品与环境中49株豚鼠气单胞菌菌种鉴定、毒力与耐药性检测。方法VITEK、API 20NE生化鉴定,gyrB、rpod系统发育分析;PCR检测act、alt、ast、lip、ahp、aerA、hlyA、ompA1、fla基因;AST-GN16药敏试验。结果生化鉴定为豚鼠/嗜水气单... 详细信息

目的食品与环境中49株豚鼠气单胞菌菌种鉴定、毒力与耐药性检测。方法VITEK、API 20NE生化鉴定,gyrB、rpod系统发育分析;PCR检测act、alt、ast、lip、ahp、aerA、hlyA、ompA1、fla基因;AST-GN16药敏试验。结果生化鉴定为豚鼠/嗜水气单胞菌株54株,经系统发育分析豚鼠气单胞菌49株,嗜水气单胞菌4株,中国台湾省气单胞菌1株。毒力基因alt、lip、ompA1、fla、act、aerA、hlyA检出率依次为100.00%、100.00%、79.59%、14.29%、2.04%、2.04%、2.04%,未检出ast、ahp;存在4种毒力基因组合,优势组合为alt/lip/ompA1(32/49)。豚鼠气单胞菌氨苄西林、头孢唑林、头孢西丁、阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、复方新诺明、安曲南耐药率依次为79.59%、14.29%、10.20%、6.12%、4.08%、4.08%、2.04%,哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、替加环素、呋喃妥英均敏感;2株多重耐药菌株。结论gyrB、rpod可有效鉴定豚鼠/嗜水气单胞菌,rpod可区分近亲缘关系豚鼠与中国台湾省气单胞菌;所有豚鼠气单胞菌均携带2种以上毒力基因,1株环境源菌携带7种毒力基因;青霉素类普遍耐药,产生β-内酰胺酶是最主要耐药机制;未发现碳青霉烯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素类、呋喃类耐药菌株;食品和生活饮用水存在多重耐药菌。

关键词：豚鼠气单胞菌嗜水气单胞菌系统发育分析 gyrB基因 rpod基因毒力基因耐药性

舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2019年第8期47卷 17-24页

作者：刘礼辉胡蕾杨圆圆方伟林强付小哲梁红茹赵永亮李宁求中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 广东省水生动物疫病预防控制中心广东广州510222 华中农业大学水产学院湖北武汉430070

【目的】建立一种快速、灵敏的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)检测方法。【方法】以舒伯特气单胞菌rpod(RNA polymerase sigma-70 factor)为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立舒伯特气单胞菌的TagMan实时荧光定量PCR检... 详细信息

【目的】建立一种快速、灵敏的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)检测方法。【方法】以舒伯特气单胞菌rpod(RNA polymerase sigma-70 factor)为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立舒伯特气单胞菌的TagMan实时荧光定量PCR检测方法,同时验证该方法的特异性、灵敏度、重复性,并用该方法对50份临床样品进行检测,验证其应用效果。【结果】含舒伯特气单胞菌rpod基因的质粒拷贝数与循环阈值(Ct)的标准曲线相关系数为1.000,扩增效率为94.705%。实时荧光定量PCR检测方法只对舒伯特气单胞菌的靶基因检测结果呈阳性,对嗜水气单胞菌(Aeromanas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、诺卡氏菌(Nocardia seriolae)等其他14种致病菌的检测结果均为阴性,具有高度特异性;对舒伯特气单胞菌重组质粒和纯培养细菌的检出灵敏度分别为4.76拷贝/μL和15 CFU/mL;批内和批间重复性试验变异系数分别为0.95%和1.05%。50份临床样品检测结果显示,该方法阳性样品检出率为22%,高于传统细菌分离方法(10%)的检出率。【结论】建立的舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于舒伯特气单胞菌的快速诊断检测和流行病学调查。

关键词：舒伯特气单胞菌 rpod基因实时荧光定量PCR

荧光假单胞菌M18 rpod克隆及其对抗生素合成的影响

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微生物学报 2003年第3期43卷 315-323页

作者：朱栋华徐汪节耿海峰张雪洪许煜泉上海交通大学生命科学技术学院上海200240

荧光假单胞菌M1 8对多种植物病原真菌具有显著的抑制作用。荧光假单胞菌(Pseuclomonesfluo rescens)M1 8能同时合成吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)两种抗生素。从M1 8的基因组中克隆了rpod基因 ,其相应的氨基酸序列与荧光假单胞... 详细信息

荧光假单胞菌M1 8对多种植物病原真菌具有显著的抑制作用。荧光假单胞菌(Pseuclomonesfluo rescens)M1 8能同时合成吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)两种抗生素。从M1 8的基因组中克隆了rpod基因 ,其相应的氨基酸序列与荧光假单胞菌CHAO中rpod蛋白的氨基酸序列完全相同。利用基因重组技术和大肠杆菌荧光假单胞菌穿梭质粒pME60 32 ,将rpod置于强启动子Ptac的控制下 ,导入M1 8菌株。发现经重组质粒转化的M1 8,与对照相比 ,培养基中PCA和Plt开始累积的时间分别提前 4h和 8h ,积累量提高 1倍和 6倍。

关键词：荧光假单胞菌 M18 克隆抗生素合成 rpod基因吩嗪-1-羧酸藤黄绿菌素

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原温和气单胞菌(Aeromonas sobria)分子鉴定及耐药性研究

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海洋与湖沼 2010年第5期41卷 756-762页

作者：姚东瑞邴旭文朱明毕可然陈丽张晓君淮海工学院海洋学院连云港222005 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室无锡214081

采用常规生理生化特性测定及16SrRNA、gyrB及rpod基因同源性检索与系统发育学分析等分子生物学方法,对引起养殖泥鳅大量死亡的病原细菌进行了综合鉴定。生理生化特性结果表明,分离菌株NQ090701与气单胞菌属的温和气单胞菌相近;16SrRNA、... 详细信息

采用常规生理生化特性测定及16SrRNA、gyrB及rpod基因同源性检索与系统发育学分析等分子生物学方法,对引起养殖泥鳅大量死亡的病原细菌进行了综合鉴定。生理生化特性结果表明,分离菌株NQ090701与气单胞菌属的温和气单胞菌相近;16SrRNA、gyrB及rpod基因Blast序列同源性检索与系统发育学分析均与温和气单胞菌相似性最高;综合形态与生理生化特征及16SrRNA、gyrB与rpod基因的分子特征,确认分离菌株NQ090701为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。同时,采用试管稀释法测定了养殖生产中常用的10种抗菌药物对病原温和气单胞菌的体外最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC),结果表明氟哌酸杀菌作用最好,其次为盐酸沙拉沙星;甲砜霉素和复方磺胺甲恶唑在所试验的药物浓度范围对温和气单胞菌无杀菌效果。

关键词：泥鳅温和气单胞菌 16SrRNA基因 gyrB基因 rpod基因耐药性

变形杆菌耐药性及其携带整合性接合元件SXT/R391的序列特征

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变形杆菌耐药性及其携带整合性接合元件SXT/R391的序列特征

作者：李欣悦中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

目的了解变形杆菌耐药现状,以期指导临床合理使用抗生素,了解中国变形杆菌携带整合性接合元件SXT/R391的序列特征。方法（1）采用微量肉汤稀释法检测分离自院内感染、粪便和食品总共249株变形杆菌对临床常用抗生素的最小抑菌浓度,根据... 详细信息

目的了解变形杆菌耐药现状,以期指导临床合理使用抗生素,了解中国变形杆菌携带整合性接合元件SXT/R391的序列特征。方法（1）采用微量肉汤稀释法检测分离自院内感染、粪便和食品总共249株变形杆菌对临床常用抗生素的最小抑菌浓度,根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）制定的标准,统计药敏结果。（2）用PCR方法检测来源于粪便和食品的共123株变形杆菌的SXT/R391特异整合酶基因int,提取阳性菌株的基因组DNA,进行第二代基因组测序（NGS）。然后从基因组序列中,根据参考序列,提取研究对象菌株中的SXT/R391序列,拼接组装。基于全序列进行结构和功能的分析。（3）用微量肉汤稀释法对SXT/R391阳性菌株进行药敏试验。构建双抗性筛选系统,进行接合试验并计算转移频率。结果所有变形杆菌对某些抗生素耐药明显,奇异变形杆菌对复方新诺明的耐药率达到47.9%,其次为氨苄西林（45.2%）、头孢唑啉（44.7%）和环丙沙星（35.6%）。普通变形杆菌对检测的抗生素的耐药率均不超过20%。两种变形杆菌对哌拉西林-他唑巴坦的耐药率最低。奇异变形杆菌对头孢吡肟、头孢替坦、阿米卡星、庆大霉素、复方新诺明和环丙沙星的耐药率高于普通变形杆菌。奇异变形杆菌院内感染来源的菌株耐药率高于食品来源和粪便来源菌株的耐药率。普通变形杆菌的来源不同,耐药率差异不大。在全部奇异变形杆菌耐药菌株中,有67株（35.6%）耐3类以上抗生素。在123株来自食品和腹泻病人粪便标本的菌株中,有15株（12.2%）为整合性接合元件SXT/R391阳性,包括2株食品来源和13株腹泻患者粪便标本来源。从测序的基因组序列中提取SXT/R391序列,15个SXT/R391序列分别与来自单胞菌（Alteromonas macleodii）,霍乱弧菌（Vibriocholerae）,变形杆菌（Proteus mirabilis）和普罗维登斯菌（Providenciastuartii）等来源的SXT/R391有最高的相似性匹配,序列的搜索覆盖率（Query cover）范围64%-99%,一致性（Ident）范围97%-100%。其中分别有9个和2个SXT/R391,与来自变形杆菌和霍乱弧菌的SXT/R391有最高的相似性匹配。在进化上,15个SXT/R391归类在6个不同的簇中,ICEPmiChn1是优势型别,另有5个ICE是本研究中新发现的型别。另外,15个SXT/R391序列的基因功能注释及结构分析结果表明,元件不仅包含SXT/R391的保守基因,在外源DNA插入区域的热点区及变异区发现了独特的编码耐药、限制性修饰系统和重金属离子汞的基因,以及功能未知的基因,在VRⅢ还发现了一个编码β-内酰胺酶的基因。15株SXT/R391阳性菌株都为多重耐药菌。最后,接合实验发现,本研究的SXT/R391在大肠杆菌中的转移频率范围3.5 ×110-6-2.5×10-2。结论我们的研究结果表明,变形杆菌对某些临床常见抗生素已产生较高的耐药性,并且多重耐药现象普遍。与耐药相关的SXT/R391元件,在变形杆菌和其他肠杆菌科细菌之间广泛传播和相互传递,同时又赋予了变形杆菌新功能如耐药性等,以增强细菌的环境适应性。因此,需要加强变形杆菌耐药性和耐药相关移动元件的连续性监测。目的本研究收集了 187株气单胞菌,使用rpod和gyrA基因对气单胞菌进行种水平的鉴定,比较两者分类结果的差异,探讨gyrA单基因用于对气单胞菌鉴定是否有效。同时对本研究中187株气单胞菌进行较为准确的种水平的分类。方法对经生化（AP120E）鉴定的187株气单胞菌,采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）对rpod和gyrA的基因片段进行扩增。将所有序列与26条种特异的参考序列一起,采用邻近比邻法（Neighbor-Joing）构建系统进化树。结果187株菌经rpod基因鉴定为7个种,经gyrA基因鉴定为9个种,还有一个未定种。两者鉴定最多的三个种一致,即维氏气单胞菌温和生物变种,豚鼠气单胞菌和水族馆气单胞菌。gyrA基因鉴定增加的两个种是异嗜糖气单胞菌和简氏气单胞菌。rpod和gyrA基因对气单胞菌鉴定一致的有174株（93%）,但有13株菌（7%）两者鉴定不一致。生化鉴定的豚鼠气单胞菌（28株）和维氏气单胞菌温和生物变种（64株）,与rpod和gyrA基因鉴定的一致性较高,介于68.8%和85.7%之间。生化鉴定为嗜水气单胞菌的95株菌株中,经rpod和gyrA基因鉴定,分别只有9.5%和6.3%。结论rpod和gyrA基因能够对大部分气单胞菌进行准确和一致地分类,对于两者鉴定不一致的菌株,应增加管家基因进行分析。

关键词：变形杆菌耐药移动元件 SXT/R391 气单胞菌 rpod基因 gyrA基因鉴定

大黄鱼致病香鱼假单胞菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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