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RAISE技术改组转录因子rpod调控大肠杆菌的低pH值耐受性

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化学与生物工程 2016年第3期33卷 14-18,52页

作者：高茜朱丽英周伟梁世中江凌南京工业大学生物与制药工程学院江苏南京210009 南京工业大学化学与分子工程学院江苏南京210009 华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510641 南京工业大学食品与轻工学院江苏南京210009

在生物炼制生产过程中,微生物由于自身对酸的抗逆性差,其代谢生产过程会受到严重的影响。为解决该问题,本实验采用PCR方法从*** DH5α中扩增分离得到分子量为2 075bp的rpod完整序列(包含天然启动子区域和终止子区域),并利用RAISE方法,... 详细信息

在生物炼制生产过程中,微生物由于自身对酸的抗逆性差,其代谢生产过程会受到严重的影响。为解决该问题,本实验采用PCR方法从*** DH5α中扩增分离得到分子量为2 075bp的rpod完整序列(包含天然启动子区域和终止子区域),并利用RAISE方法,通过突变全局调控因子rpod来提高大肠杆菌的耐酸能力。通过对104随机突变文库的多轮筛选,获得最佳突变菌株MutantⅦ。在pH值为3.0、3.5、4.0、5.0、6.0和7.0的条件下,对MutantⅦ和对照菌株的生长情况进行比较分析,结果表明,在酸性条件下MutantⅦ较对照菌株具有明显的生长优势,尤其在pH值为3.0时,相比对照菌株0.015h-1的生长速率,MutantⅦ的生长速率达到0.022h-1,具有较高应用价值。

关键词：大肠杆菌耐酸性 rpod RAISE方法

用gyrB、rpod基因扩增测序进行气单胞菌分类的探讨

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临床检验杂志 2015年第8期33卷 569-572页

作者：贺桃凤李医陈晓陈瑜浙江大学医学院杭州310010 宁波市北仑区人民医院梅山分院检验科浙江宁波315000 新疆维吾尔自治区职业病医院检验科新疆维吾尔自治区830091 浙江大学医学院附属第一医院检验科杭州310010

目的获得气单胞菌更准确的分类结果。方法收集经Vitek全自动细菌分析仪及配套的GN鉴定卡鉴定为气单胞菌的菌株231株,对其gyr B、rpo D两个管家基因进行PCR扩增及测序,并与Gen Bank中标准序列进行基因序列比对和单核苷酸替代率分析,综合... 详细信息

目的获得气单胞菌更准确的分类结果。方法收集经Vitek全自动细菌分析仪及配套的GN鉴定卡鉴定为气单胞菌的菌株231株,对其gyr B、rpo D两个管家基因进行PCR扩增及测序,并与Gen Bank中标准序列进行基因序列比对和单核苷酸替代率分析,综合分析gyr B、rpo D两基因测序结果并进行基因分类。结果 231株气单胞菌中,69株(29.9%)gyr B和rpo D基因均获得测序结果,86株(37.2%)仅获得gyr B序列,50株(21.6%)仅获得rpo D序列,26株(11.3%)两种基因均未获得序列。生化表型鉴定为嗜水气单胞菌的菌株中62.7%基因分类结果为达卡气单胞菌,仅22.4%为嗜水气单胞菌,其种间生化反应结果相近。结论气单胞菌属的生化分类与基因分类结果存在差异。达卡气单胞菌与嗜水气单胞菌的鉴定依赖于基因序列分析。

关键词：气单胞菌基因分类 gyrB rpod 嗜水气单胞菌达卡气单胞菌

基于全局转录工程促进肺炎克雷伯氏菌吡咯喹啉醌的生物合成

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北京化工大学学报（自然科学版） 2014年第3期41卷 92-96页

作者：张军静田平芳北京化工大学生命科学与技术学院北京市生物加工过程重点实验室北京100029

用易错PCR构建肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)RNA聚合酶rpod基因的突变文库,将其与载体连接后转化肺炎克雷伯氏菌,从1500个阳性克隆中筛选出一株吡咯喹啉醌(PQQ)生产菌。发酵试验表明,该工程菌的PQQ产量为76mg/mL,比携带未突变r... 详细信息

用易错PCR构建肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)RNA聚合酶rpod基因的突变文库,将其与载体连接后转化肺炎克雷伯氏菌,从1500个阳性克隆中筛选出一株吡咯喹啉醌(PQQ)生产菌。发酵试验表明,该工程菌的PQQ产量为76mg/mL,比携带未突变rpod基因的对照菌提高了10%。测序发现rpod基因在核酸和蛋白质水平的突变率分别达到2.5%和0.5%。二级结构预测发现α螺旋、β转角和无规则卷曲数目均发生了变化,推测由此改变了σ因子与启动子的亲和程度,从而导致了PQQ基因的转录以及***代谢流量再分配,使得PQQ得到更高效表达。

关键词：肺炎克雷伯氏菌 σ因子 rpod 吡咯喹啉醌

青虾源维氏气单胞菌双重PCR检测方法的建立

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淡水渔业 2020年第1期50卷 76-81页

作者：刘晓丹肖自东孙威李席席周一凡张晓君扬州大学动物科学与技术学院

根据NCBI已发表的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)促旋酶B亚单位基因gyrB和编码细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpod的保守序列设计引物,建立了一种快速检测青虾源维氏气单胞菌的双重PCR检测方法。结果显示:青虾源维氏气单胞菌gyrB和rpod基... 详细信息

根据NCBI已发表的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)促旋酶B亚单位基因gyrB和编码细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpod的保守序列设计引物,建立了一种快速检测青虾源维氏气单胞菌的双重PCR检测方法。结果显示:青虾源维氏气单胞菌gyrB和rpod基因PCR扩增产物大小分别为815 bp、554 bp,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、非O1霍乱弧菌(non-O1 Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)扩增结果皆为阴性;灵敏性试验结果显示该方法检测到的最低菌体DNA量为1.8×10-2 ng/μL,且10份送检样本检测结果与传统细菌分离鉴定结果相一致。结果表明,双重PCR检测方法特异性好、灵敏性高,适用于青虾源维氏气单胞菌的快速检测。

关键词：青虾(Macrobrachium nipponense) 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii) gyrB rpod 双重PCR 检测技术

超酸性蛋白融合标签对大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的作用研究

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超酸性蛋白融合标签对大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的作用研究

作者：曹丽娟华东师范大学

学位级别：硕士

蛋白质工程一直是生物技术研究的一个重要方面。在科学研究中,获得大量纯化、可溶性的、有生物活性的蛋白质是蛋白质理化性质与功能研究的基础。然而受资源有限、成本昂贵等因素的影响,天然的蛋白质无法满足实际需要。随着蛋白质工程和... 详细信息

蛋白质工程一直是生物技术研究的一个重要方面。在科学研究中,获得大量纯化、可溶性的、有生物活性的蛋白质是蛋白质理化性质与功能研究的基础。然而受资源有限、成本昂贵等因素的影响,天然的蛋白质无法满足实际需要。随着蛋白质工程和基因工程技术的发展,重组蛋白在理化性质和生物学活性上已日趋接近于天然蛋白质,且可以通过大规模生产源源不断地获得。虽然20世纪90年代后开始频繁利用哺乳动物细胞来生产重组蛋白,但迄今为止原核的大肠杆菌表达系统还是最常用的,因为大肠杆菌的遗传背景清楚,培养条件简单,表达高效,经济方便。但是,大肠杆菌表达系统也有局限性,当所表达的蛋白是复杂的真核来源的蛋白时,大肠杆菌常常不能将翻译出的多肽链正确折叠修饰形成蛋白质的天然构象,而是形成不溶性的无功能的包涵体。包涵体中多肽链活性恢复必须通过复杂的变性复性过程,而且成功率低。因此,探索重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。目前已经找到了一些提高重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法,其中较常用的办法是使用融合表达策略,即将融合标签和靶蛋白连接成为一个融合蛋白进行表达。但由于蛋白质种类繁多,目前还没有找到可以提高蛋白可溶性表达的通用型融合标签。本工作中,我们致力于寻找一类通用的增溶标签来促进靶蛋白(尤其是那些用常规增溶办法无法解决的蛋白)在大肠杆菌中的可溶性表达。基于此,我们设计挑选了三种大肠杆菌来源、分子量相对较小和酸度超强的融合标签即Msb(大肠杆菌酸性蛋白MsyB)、Yd(一个推定的大肠杆菌开放阅读框蛋白,yjgD)和Od(大肠杆菌RNA聚合酶σ70因子rpod的N端区);分析它们对三种具有高度聚集倾向性的靶蛋白即小牛肠激酶(EK)、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)和1,5—二磷酸核酮糖羧化/加氧酶大亚基rbcL(Rb)在大肠杆菌中可溶性表达的影响。同时,选用一些常用融合标签如大肠杆菌Trx(硫氧还蛋白)、MBP(麦芽糖结合蛋白)、NusA和酵母SUMO蛋白与它们一起进行作用比对。通过PCR或酶切得到融合标签Msb、Yd、Od、MBP、NusA、Trx和SUMO的基因,然后以质粒pET-32a(+)为骨架与靶蛋白基因融合构建一系列融合表达载体,并将它们在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,与常用标签Trx等相比,三个超酸性标签蛋白Yd、Od和Msb都能够卓著地增强靶蛋白(EK、TEV和Rb)的可溶性表达。另外,我们还构建了杂合标签MS、YS、OS、NS和PS(即SUMO分别与标签Msb、Yd、Od、NusA和MBP的杂合体)与靶蛋白的融合表达载体,结果表明,酸性杂合标签MS,YS,OS也能够显著地增强靶蛋白的可溶性表达。这些实验结果很好地验证了用Wilkinson-Harrison可溶性模型得到的理论预测。进一步,我们利用酵母蛋白酶Ulp1切割SUMO融合蛋白的反应体系和TEV融合蛋白自切割反应体系评估了所选三种超酸性融合标签Msb、Yd和Od的作用机理。结果表明这些超酸性融合标签在显著增强靶蛋白可溶性表达的过程中实际上起着分子内伴侣作用,有效地帮助靶蛋白的正确结构折叠。总之,本工作发现超酸性蛋白Msb、Yd、Od可以作为一类通用高效的增溶性融合标签来促进大肠杆菌中靶蛋白的可溶性表达,相信它们在蛋白质研究及其生物技术领域内有着很好的应用前景。

关键词：超酸性蛋白融合标签 yjgD rpod msyB 蛋白可溶性表达分子内伴侣