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rolc基因对转Ri质粒三倍体毛白杨的遗传转化

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西北林学院学报 2007年第5期22卷 57-61页

作者：苏彦苹刘兴菊周怀军杨敏生梁海永河北农业大学林学院河北保定071001

通过对Ri质粒转化三倍体毛白杨植株转入rolc基因,使外源基因rolc在植物体内形成多拷贝,从而对rolc基因表达产生干扰,而减少Ri质粒转化三倍体毛白杨造成的不良形态变异。本研究建立了转Ri质粒三倍体毛白杨的叶片再生体系,筛选出叶片再生... 详细信息

通过对Ri质粒转化三倍体毛白杨植株转入rolc基因,使外源基因rolc在植物体内形成多拷贝,从而对rolc基因表达产生干扰,而减少Ri质粒转化三倍体毛白杨造成的不良形态变异。本研究建立了转Ri质粒三倍体毛白杨的叶片再生体系,筛选出叶片再生的最佳培养基为:MS+6-BA 1.0 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1;确定了卡那霉素(Km)和抑菌抗生素头孢噻肟钠(CTX)的临界浓度为30 mg.L-1和400 mg.L-1;采用农杆菌介导的叶盘法,将rolc基因转入经发根农杆菌Ri质粒30148转化的三倍体毛白杨植株中,获得了18个Km抗性系,对其中14个株系进行了PCR检测,表明rolc基因已整合进再生植株中。与转Ri质粒三倍体毛白杨和未转基因三倍体毛白杨相比,部分转Ri质粒三倍体毛白杨在转rolc基因后发生了形态特征变异,比如部分无性系的叶片由原来的皱缩变为平展,部分无性系的茎由原来的直立变为弯曲,侧枝增多,节间距明显缩短。

关键词： rolc基因转化形态变异

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rolc基因转化葡萄砧木‘5BB’的研究

rolC基因转化葡萄砧木‘5BB’的研究

作者：李金凤南京农业大学

学位级别：硕士

本研究以葡萄砧木‘5BB’(V.berlandierixV.riparia)为材料，建立了叶柄不定芽离体再生的体系，采用农杆菌介导法和超声波辅助农杆菌介导法两种方法将rolc基因导入葡萄砧木‘5BB’中，系统地探讨了提高‘5BB’再生率和影响遗传转化效率... 详细信息

本研究以葡萄砧木‘5BB’(V.berlandierixV.riparia)为材料，建立了叶柄不定芽离体再生的体系，采用农杆菌介导法和超声波辅助农杆菌介导法两种方法将rolc基因导入葡萄砧木‘5BB’中，系统地探讨了提高‘5BB’再生率和影响遗传转化效率的因子，优化了农杆菌介导法的主要技术参数，建立了超声波辅助农杆菌介导法的遗传转化体系。研究结果如下：1．以葡萄砧木‘5BB’试管苗离体叶柄为外植体诱导不定芽再生。研究了不同基本培养基、外植体类型、植物生长调节剂的种类及其浓度组合等因素对‘5BB’再生的影响。结果表明，MS基本培养基为较适合的叶柄再生基本培养基，着生于顶端第2、3节位的叶柄为适宜的外植体，适于叶柄再生的植物生长调节剂种类及浓度组合为BA2.5mg／L，IBA0.05mg／L，叶柄再生频率最高可达到43.33％。2．以葡萄砧木‘5BB’的叶柄为农杆菌介导转化受体，通过对GUS基因瞬时表达率的分析，优化了农杆菌介导的遗传转化技术体系。实验表明，侵染4min、共培养2d、预培养3d，卡那霉素选择压2.5mg／L，头胞霉素浓度250mg／L时可获得40％的GUS瞬时表达率。3、建立了超声波辅助农杆菌介导法转化葡萄砧木‘5BB’的遗传转化体系：茎段为适合的外植体类型，超声波处理时间为8s，功率为100W，AS为75mg／L时GUS瞬时表达率最高可达40％。4、将rolc基因转入葡萄砧木‘5BB’中，经GUS组织化学染色和PCR扩增检测，初步断定rolc基因已整合到‘5BB’2个株系的基因组中。

关键词：葡萄砧木'5BB' 再生农杆菌介导超声波辅助农杆菌介导 rolc基因

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rolc基因转化‘美人指’葡萄的研究

rolC基因转化‘美人指’葡萄的研究

作者：杨丽娜南京农业大学

学位级别：硕士

本研究以‘美人指’葡萄(Vitis vinifera L‘Manicure Finger’)为材料,建立培养方法简单的不定芽再生体系,并在此基础上采用农杆菌介导法和花粉管通道法,将rolc基因导入‘美人指’葡萄,以达到减缓‘美人指’葡萄的生长势、促进其花芽... 详细信息

本研究以‘美人指’葡萄(Vitis vinifera L‘Manicure Finger’)为材料,建立培养方法简单的不定芽再生体系,并在此基础上采用农杆菌介导法和花粉管通道法,将rolc基因导入‘美人指’葡萄,以达到减缓‘美人指’葡萄的生长势、促进其花芽的形成的目的。研究结果如下: 1.以‘美人指’葡萄叶片、叶柄和茎段为外植体,用不同浓度6-BA、TDZ与IBA组合在不同的基本培养基上诱导再生植株。结果表明:在MS、B和NN3种基本培养基中,外植体均可直接再生不定芽,且再生率和出芽数差异不显著;6-BA与IBA组合中,MS+6-BA3.0 mg/L+IBA0.1 mg/L再生率最高,为6%;TDZ与IBA不同组合中,MS+TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.2mg/L再生率最高,为4%。 2.以‘美人指’葡萄离体叶片、叶柄和茎段为农杆菌介导转化rolc基因的受体,对农杆菌侵染时间、共培养时间、卡那霉素选择压及头孢霉素浓度等因素进行了研究。结果表明:农杆菌侵染4min,共培养3d,卡那霉素选择压3mg/L,头孢霉素浓度250mg/L为最佳的农杆菌介导法‘美人指’葡萄遗传转化体系。 3.采用优化的农杆菌介导转化体系,对‘美人指’进行转化,共获得了12株抗性苗。利用GUS组织化学染色、PCR扩增及RT-PCR检测,结果表明,有2株抗性苗GUS染色呈阳性,其中有1株通过PCR和RT-PCR检测均扩增到540bp的条带,与rolc基因完全一致,证实rolc基因已经整合进入‘美人指’葡萄基因组中,并得到了表达。 4.以‘美人指’葡萄花序为农杆菌介导转化rolc基因的受体,利用花粉管通道法对‘美人指’葡萄进行转化,共获得了40株后代单株。利用GUS组织化学染色、PCR及RT-PCR方法进行检测,结果表明,5株GUS染色呈阳性,GUS阳性率为12.5%;对其中的22株抗性株系进行PCR和RT-PCR检测,证实rolc基因已经整合进入2个株系的基因组中,并得到了表达。

关键词： ‘美人指’葡萄 rolc基因农杆菌介导花粉管通道法检测

转rolc基因八棱海棠组培苗生物学特性的研究

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中国农业科学 2006年第12期39卷 2563-2569页

作者：丛郁孙爱君姚泉洪章镇南京农业大学园艺学院南京农业大学园艺学院南京210095

目的通过研究转rolc基因八棱海棠不同株系的转基因拷贝数,在转录水平上的表达丰度,以及转基因组培苗的生物学特性,为进一步深入阐明rolc基因在八棱海棠中的表达机制和培育优良的苹果砧木奠定理论基础。方法以通过gus染色和PCR检测的3个... 详细信息

目的通过研究转rolc基因八棱海棠不同株系的转基因拷贝数,在转录水平上的表达丰度,以及转基因组培苗的生物学特性,为进一步深入阐明rolc基因在八棱海棠中的表达机制和培育优良的苹果砧木奠定理论基础。方法以通过gus染色和PCR检测的3个转rolc基因八棱海棠株系组培苗为试材。Southern杂交鉴定rolc基因整合拷贝数。Northern杂交鉴定rolc基因在转录水平上的表达丰度。调查转基因植株组培苗在含有不同种类和浓度的植物生长调节剂的培养基上茎段增殖、叶片再生、生根能力等生物学特性;将生根后的组培苗进行炼苗,移入温室4个月后,研究株高、节间数、节间长度、叶面积等生物学特性。结果Southern杂交结果表明,rolc基因分别整合进入3个八棱海棠株系基因组,其中株系20a和33a分别获得了1个rolc基因拷贝,株系20b获得了2个rolc基因拷贝。Northern杂交结果表明,3个转基因株系中的rolc基因均在转录水平上得到了表达,且该基因在单拷贝株系的表达丰度高于双拷贝株系。转基因组培苗生物学特性研究结果表明:(1)3个转rolc基因八棱海棠株系茎段增殖系数、叶片再生率、生根所需外源激素浓度均显著低于对照植株,单拷贝株系的以上指标亦显著低于双拷贝株系。(2)3个转基因八棱海棠株系组培苗平均生根数显著高于转基因株系,双拷贝株系显著低于单拷贝株系;根长情况正好相反;对照植株根粗和转基因株系根粗之间均无显著差异。(3)3个转基因八棱海棠株系的株高、节间长度、节间数、叶面积均显著小于对照植株。其中单拷贝株系显著小于双拷贝株系。结论rolc基因整合进入3个八棱海棠转基因株系基因组,并分别在转录水平上得到表达。外源rolc基因的表达导致转基因植株体内内源激素含量和植株形态学的改变,且rolc基因的整合拷贝数对它的表达有一定的影响。

关键词：八棱海棠(Malusrobusta Rehd.) rolc基因拷贝数组培苗生物学特性

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发根农杆菌rolc基因的克隆及序列分析

西北林学院学报 2007年第2期22卷 72-75页

作者：刘兴菊梁海永杨敏生周怀军河北农业大学林学院河北保定071000

以发根农杆菌30148为材料,设计了rolc基因的特异性引物,应用PCR技术,扩增出了正确序列的rolc基因585 bp片段,并利用pUCm-T载体对此片段进行了克隆,并进行了序列分析。所克隆rolc基因与已发表的序列相比较,核苷酸序列的同源性达到100%,... 详细信息

以发根农杆菌30148为材料,设计了rolc基因的特异性引物,应用PCR技术,扩增出了正确序列的rolc基因585 bp片段,并利用pUCm-T载体对此片段进行了克隆,并进行了序列分析。所克隆rolc基因与已发表的序列相比较,核苷酸序列的同源性达到100%,但另一个克隆中部分碱基发生了改变,同源性达到99%。

关键词： Ri质粒 rolc基因克隆

超声波辅助农杆菌介导八棱海棠转rolc基因

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果树学报 2006年第5期23卷 659-663页

作者：丛郁王三红王红霞姚泉洪章镇南京农业大学园艺学院南京210095 上海市农业遗传重点实验室上海市农业科学院生物技术研究中心上海201106

应用超声波辅助农杆菌介导法,对八棱海棠进行rolc基因转化,以期提高转化效率并获得转基因植株。利用gus基因瞬间表达的方法研究了超声波处理时间、处理时期和农杆菌悬浮液中乙酰丁香酮(As)浓度对rolc基因转化率的影响。结果表明,叶盘在D... 详细信息

应用超声波辅助农杆菌介导法,对八棱海棠进行rolc基因转化,以期提高转化效率并获得转基因植株。利用gus基因瞬间表达的方法研究了超声波处理时间、处理时期和农杆菌悬浮液中乙酰丁香酮(As)浓度对rolc基因转化率的影响。结果表明,叶盘在D600nm为0．6且含有75 mg／L As的农杆菌悬浮液中侵染2 min后,用功率为100 W的超声波处理30 s,再浸泡2．5 min,然后放到再生培养基上共培养3 d,能获得最佳的gus基因瞬间表达率。最佳处理条件下转化683枚八棱海棠叶片,共得到138个抗性愈伤组织和15株抗性苗,转化率为2．2％。GUS染色、PCR及Southern blotting检测结果显示,有12个八棱海棠株系的基因组中整合了完整的外源rolc基因。

关键词：八棱海棠超声波辅助农杆菌转化 rolc基因

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欧李转rolc基因的检测及功能表达研究

欧李转rolC基因的检测及功能表达研究

作者：寿纪培山西农业大学

学位级别：硕士

欧李(Cerasus humilis(Bge)Sok.)是一种在我国北方分布广泛的新兴小灌木果树,本研究通过对农杆菌介导法得到且GUS染色阳性的欧李转rolc植株T1、T2、T3、T4、T5、T6进行分子检测。采用RT-PCR技术检测外源rolc基因在转录水平的表达情况;... 详细信息

欧李(Cerasus humilis(Bge)Sok.)是一种在我国北方分布广泛的新兴小灌木果树,本研究通过对农杆菌介导法得到且GUS染色阳性的欧李转rolc植株T1、T2、T3、T4、T5、T6进行分子检测。采用RT-PCR技术检测外源rolc基因在转录水平的表达情况;用绝对实时荧光定量检测rolc基因的拷贝数;同时对转rolc基因株系的欧李部分生物学特性进行研究。研究结果如下： 1.以GUS染色呈阳性的欧李和对照欧李的叶片为材料,用RT-PCR检测rolc基因的转录表达情况发现：6个转rolc基因中T1、T2、T4均在转录水平上获得表达,扩增出与rolc大小一致的条带,T3、T5、T6与CK则没有扩增出相应条带。为了检测rolc基因的遗传表达稳定性,将6个转rolc基因和对照欧李无性繁殖的继代苗和低温逆境胁迫的继代苗进行RT-PCR扩增。其结果表明,欧李转rolc基因在无性繁殖和低温胁迫下,外源rolc基因能够稳定遗传并在转录水平上得到表达。 2.用荧光定量PCR测定外源rolc基因的绝对拷贝量,通过实验构建质粒标准曲线,标准曲线得到的回归方程为Y=-3.0681gX+41。其相关系数R2=0.986,溶解曲线为单峰性,检测结果发现用农杆菌介导转化方法得到的转基因植株中,含有的外源基因的拷贝数不同,株系T3中rolc基因的起始拷贝数最高为3.38×106,其次是株系T2拷贝数是1.87×106,T5与T6中拷贝数则比较低,株系T5的rolc基因的起始拷贝数为6.20×103。 3.将转rolc基因欧李和对照分别在不同种类和浓度的植物生长调节剂的培养基上进行茎段增殖和生根特性研究,发现转rolc基因株系和对照在生物学特性上发生了显著变化,株系T2和T4组培苗在壮苗培养时出现了生根。而当把各个株系接入相同的生根培养基中,株系T1、T2、T3、T4极显著的高于CK的生根率,T5生根率显著高于CK,T6则与CK生根率差异不显著。在根长方面,株系T1、T2、T4根系长度极显著长于CK;T3、T5显著的增长于CK;T6根长与CK差异不显著。在不同激素浓度的分化培养基中,转rolc株系和CK均表现出随6-BA浓度的增加出现先上升后下降的趋势。当6-BA为0.3mg/L时,增殖系数均达到最高值;6-BA大于0.3mg/L时,CK的增殖率显著高于转rolc株系。生根苗移栽后25天后,CK、T5株高增幅显著高于其他株系。移栽四个月后CK株高增幅显著于转rolc株系,且CK株高极显著于T1、T2、T4,显著于T3、T5、T6。CK的节间数显著的多于转rolc株系;在节间长度方面CK与T5不显著,显著于其他株系。

关键词：欧李 rolc基因 RT-PCR 荧光定量PCR

rolB、rolc基因对转Ri质粒三倍体毛白杨的转化

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rolB、rolC基因对转Ri质粒三倍体毛白杨的转化

作者：苏彦苹河北农业大学

学位级别：硕士

Ri质粒上含有诱根基因即rol基因，将Ri质粒或单个或几个rol基因组合导入植物体内均能提高植物的生根能力，但是某些植物在转入rol基因后往往会使植株表现出一些不良的变异，如出现了植株矮化、叶面皱缩、节间缩短、分支能力增强等性状... 详细信息

Ri质粒上含有诱根基因即rol基因，将Ri质粒或单个或几个rol基因组合导入植物体内均能提高植物的生根能力，但是某些植物在转入rol基因后往往会使植株表现出一些不良的变异，如出现了植株矮化、叶面皱缩、节间缩短、分支能力增强等性状，对植物的生长发育产生很大的影响。为减少rol基因对植物造成的不良变异，本文以刘兴菊研究的转Ri质粒30148菌株的三倍体毛白杨3个无性系为研究对象，通过对叶片再生体系和遗传转化条件的优化，建立了高效离体再生系统和遗传转化体系，并将rolB、rolc诱根基因导入转Ri质粒的三倍体毛白杨，对部分转化再生植株进行了形态鉴定、PCR检测和GUS组织化学染色检测，并对转化植株形态及生长变异和叶片解剖结构进行了初步研究，主要研究内容及结果如下： 1．进行了叶片外殖体高效再生系统的研究，筛选出转Ri质粒的三倍体毛白杨叶片诱导不定芽的适宜培养基为：MS+6-BA1.0mg．L+NAA0.05mg．L，诱导不定根的适宜培养基为：MS+NAA0.1mg．L。并以此种诱导不定芽的适宜培养基，研究了暗培养对诱导叶片不定芽的影响，结果表明，暗培养5d对不定芽诱导是有利的。 2．通过卡那霉素(Km)敏感性试验，确定了诱导叶片外殖体不定芽的Km临界耐受浓度为30mg．L。同时研究了头孢噻肟钠(CTX)对诱导转Ri质粒的三倍体毛白杨叶片不定芽的影响和对农杆菌的抑菌效果，结果表明，CTX适宜的抑菌浓度为400mg．L。 3．对影响农杆菌转化效率的几个主要因素进行研究发现，转Ri质粒的三倍体毛白杨叶片外殖体适宜的侵菌时间是8min，侵染后共培养2d可获得较好的转化效果。 4．分别将含质粒pCMB-B∶GUS和pPCV002-CaMVC的农杆菌与转Ri质粒的三倍体毛白杨叶片共培养，通过在50mg．LKm的培养基上筛选后，获得了Km抗性植株，对部分抗性植株进行了PCR检测，证明rolB、rolc基因已整合到转Ri质粒三倍体毛白杨的基因组中，对部分PCR检测呈阳性的pCMB-B∶GUS转基因无性系进行组织化学染色分析表明，GUS基因主要在根尖、茎及叶脉维管束组织中特异表达。 5．进行了转基因植株形态及生长变异的研究，发现与转Ri质粒三倍体毛白杨相比，大部分转rolB基因无性系植株矮化，叶面积增加，茎分支能力增强，节间距缩短，生根率及根数量降低，高生长量减少;大部分转rolc基因无性系叶面由原来的皱缩变为平展，茎分支能力增强，节间距缩短明显，生根率、根数量及高生长量增加。 6．对转基因植株叶片解剖结构及组织厚度进行了观察，结果表明，转基因无性系叶片解剖结构变化不明显。大部分转rolB基因无性系叶片厚度、叶肉厚度与其转Ri质粒无性系对照相比差异显著，栅栏组织和海绵组织厚度差异不显著，50％的转rolB基因无性系的表皮厚度与其转Ri质粒无性系对照相比差异显著。大部份转rolc基因无性系叶片厚度、叶肉厚度与其转Ri质粒无性系对照相比差异不显著。转Ri质粒不同无性系在转rolc基因后，栅栏组织厚度变异程度不同，75％的转rolc基因无性系海绵组织厚度与其转Ri质粒无性系对照有显著差异。转rolc基因无性系的表皮厚度与其转Ri质粒无性系对照无显著差异。

关键词：转Ri质粒三倍体毛白杨 rolB基因 rolc基因遗传转化生长变异

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Ri质粒的快速提取及rolc基因的克隆

特产研究 2003年第2期25卷 2-4,8页

作者：李昌禹马海琴赵寿经臧埔中国农业科学院特产研究所吉林吉林132109

介绍Ri质粒的快速提取方法,提取的质粒可用于目的基因的扩增,应用rolc基因的特异性引物,扩增出了正确序列的rolc基因0.87kb片段,并利用pGEM—T载体对此片段进行了克隆。

关键词： Ri质粒快速提取 rolc基因基因克隆 pGEM-T载体