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rno-mir-30b-5p对葡萄膜炎大鼠Notch1和Dll4基因表达的调控作用

眼科新进展 2019年第1期39卷 12-16页

作者：殷学伟刘滨魏慧霞唐凯毕宏生郭大东山东中医药大学山东省中西医结合眼病防治重点实验室山东中医药大学眼科研究所山东省济南市250002

目的探讨rno-mir-30b-5p对Notch1和Dll4基因表达的调控作用及其在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)中的表达变化。方法应用双荧光素酶检测rno-mir-30b-5p对Notch1和Dll4基因表达的调控作用。6～8周龄健康Lewis大鼠12只,随机分为对照组和EAU模型组,EAU模型组大鼠建立EAU模型。于免疫后12 d分离大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织,Q-pCR检测rno-mir-30b-5p、Notch1和Dll4基因的表达水平,ELISA检测Notch1和Dll4蛋白的表达变化;流式细胞仪检测两组大鼠脾脏和淋巴结中Th17和Treg细胞的表达水平。结果双荧光素酶检测结果表明,Notch1和Dll4为rno-mir-30b-5p调控的靶基因。Q-pCR分析结果显示,相比于正常对照组(1. 00),免疫后12 d,rno-mir-30b-5p基因在EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中的相对表达水平分别为0. 41±0. 12、0. 37±0. 09和0. 25±0. 07,均呈显著下调表达,而Notch1和Dll4基因呈显著上调表达,且差异均有统计学意义(均为p 5)。ELISA检测结果显示,免疫后12 d,EAU模型组大鼠脾脏、淋巴结和眼组织中Notch1和Dll4蛋白的表达水平均明显高于对照组(均为p 5)。流式细胞仪检测结果显示,免疫后12 d,EAU模型组大鼠脾脏和淋巴结中Th17细胞因子的表达水平明显升高,而Treg细胞因子的表达水平明显降低。结论 rno-mir-30b-5p可负调控Notch1和Dll4基因的表达。在EAU模型大鼠的脾脏、淋巴结和眼组织中,rno-mir-30b-5p的下调表达可使Notch1和Dll4基因的表达水平显著升高,并使Th17/Treg比例发生紊乱,从而影响葡萄膜炎的发生发展。

关键词： rno-mir-30b-5p Notch1 Dll4 实验性自身免疫性葡萄膜炎

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rno-mir-30b-5p调控Atg5、Atg12和becn1自噬基因表达在实验性自身免疫性葡萄膜炎中的作用

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眼科新进展 2018年第4期38卷 301-305页

作者：刘滨孙园园殷学伟唐凯王慧毕宏生郭大东山东中医药大学山东省中西医结合眼病防治重点实验室山东中医药大学眼科研究所山东省济南市250002 山东省交通医院山东省济南市250031

目的探讨rno-mir-30b-5p对Atg5、Atg12和becn1自噬基因表达的调控作用及其在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)中的表达变化。方法双荧光素酶检测mo-mir-30b-5p对Atg5、Atg12和becn1自噬基因表达的调控作用。Lewis大鼠随机分为正常对照组和EAU组,每组各6只,EAU组诱导EAU模型,两组大鼠每天用Genesis-A眼底相机观察眼底情况。免疫后12 d,取眼球观察睫状体、视网膜的病理学表现;分离大鼠的脾脏和淋巴结,实时荧光定量pCR(Q-pCR)检测rno-mir-30b-5p、Atg5、Atg12和becn1 mRNA的表达情况;ELISA方法检测Atg5、Atg12和becn1蛋白的表达水平。结果双荧光素酶检测结果证实Atg5、Atg12和becn1为rno-mir-30b-5p调控的靶基因。免疫后12 d,EAU组大鼠眼底血管严重肿胀,病理学检测可见睫状体、视网膜内大量炎性细胞浸润。Q-pCR检测结果示,与正常对照组相比,免疫后12 d EAU组大鼠脾脏和淋巴结中rno-mir-30b-5p mRNA水平分别为0.46±0.01和0.29±0.17,均呈下调表达(均为p5、Atg12和becn1 mRNA水平均呈上调表达,差异均有统计学意义(均为p5)。ELISA检测结果示,EAU组大鼠脾脏和淋巴结中Atg5、Atg12和becn1蛋白表达水平均明显高于正常对照组大鼠(均为p5)。结论 rno-mir-30b-5p可调控Atg5、Atg12和becn1的表达。在EAU大鼠脾脏和淋巴结中,rno-mir-30b-5p的下调表达使Atg5、Atg12和becn1基因和蛋白的表达水平均明显升高,从而影响葡萄膜炎的发展进程。

关键词： rno-mir-30b-5p Atg5 Atg12 becn1 葡萄膜炎

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rno-mir-30b-5p对葡萄膜炎大鼠白介素-10、Toll样受体4表达的调控作用及临床研究

rno-mir-30b-5p对葡萄膜炎大鼠白介素-10、Toll样受体4表达的调控...

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作者：孙园园山东中医药大学

学位级别：硕士

目的1.研究自身免疫性葡萄膜炎患者外周血T淋巴细胞中mir-30b-5p的表达水平以及白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)、Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR 4)mRNA和蛋白的表达水平变化,进而探讨mir-30b-5p、IL-10和TLR 4在葡萄膜炎发病中的作用机制。2.研究在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠模型中rno-mir-30b-5p在眼球、脾脏和淋巴结组织中的表达水平改变及IL-10和TLR4mRNA和蛋白的表达水平改变与葡萄膜炎之间的关系;探讨EAU大鼠脾脏和淋巴结T细胞中加入rno-mir-30b-5p模拟剂和抑制剂干预后IL-10,TLR4表达失衡与EAU发生之间的关系。方法1.收集处于活动期的前葡萄膜炎患者及健康人群外周血4ml,分离收集外周血T淋巴细胞,采用实时荧光定量pCR检测mir-30b-5p、IL-10和TLR4的基因表达变化;ELISA检测血清中IL-10、TLR4的蛋白浓度变化;2.对IL-10、TLR4基因序列及载体序列进行分析后,通过pCR扩增获得IL-10、TLR4基因的3’UTR序列;在野生型(WT)载体基础上,以IL-10、TLR4基因的3′UTR序列为模板,在引物上引入突变碱基,获得定点突变序列。将野生型和突变型(Mut)目的基因片段分别克隆到pmir-Rb-REpORT?双荧光素酶报告载体中,成功构建质粒载体和突变质粒载体;同时,将rno-mir-30b-5p mimic与构建好的报告基因载体共转染293T细胞,通过报告基因相对荧光值的表达改变分析rno-mir-30b-5p与靶基因之间是否存在调控作用关系;3.随机挑选6周龄雌性Lewis大鼠分为正常对照组和EAU组,每组各6只,其中EAU组大鼠注射光感受器间维生素A类结合蛋白(IRbp)、完全弗氏佐剂(CFA)、结合菌素(Tb)和pbS300μl乳糜液以诱导EAU模型,正常对照组大鼠相同部位注射等量不含IRbp的乳化液。免疫后每天用Genesis-D眼部照相机观察EAU大鼠眼部炎症变化,并进行临床评分。当EAU大鼠在第12天达到炎症达高峰期时,过量麻醉处死大鼠,摘取大鼠眼球分别进行HE病理染色,比较大鼠眼组织病理学差异;pCR检测rno-mir-30b-5p的表达。同时分离淋巴结和脾脏组织,通过pCR检测rno-mir-30b-5p和IL-10、TLR4基因的表达变化,ELISA检测IL-10和TLR4蛋白的表达变化。4.用大鼠淋巴细胞分离液分离收集EAU大鼠脾脏、淋巴结的T淋巴细胞,分别用促进和抑制rno-mir-30b-5p表达的rno-mir-30b-5p模拟剂(mimic)和拮抗剂(inhibitor)进行T细胞转染,通过流式细胞仪检测各组T细胞的IL-10、TLR4表达变化,pCR检测转染后各组T细胞中IL-10、TLR4基因的表达变化,ELISA检测转染后各组T细胞中IL-10和TLR4蛋白的表达变化。结果***检测发现:前葡萄膜炎患者活动期外周血T淋巴细胞中mir-30b-5p的表达水平升高,而IL-10和TLR4 mRNA出现明显的下调表达(均为p5);ELISA检测发现,血清中IL-10、TLR4蛋白水平也显著下调表达(均为p5);2.根据靶基因鉴定进行分析,发现rno-mir-30b-5p mimic对IL-10、TLR4野生型的报告荧光有明显的下调作用,对其预测靶位点进行突变后,突变型载体中的报告荧光也存在明显的下调作用;***大鼠免疫后第12天炎症达到高峰,组织病理学检查结果与眼底照相机观察眼前段炎性表现结果一致。pCR检测结果表明,rno-mir-30b-5p在EAU大鼠眼球、脾脏和淋巴结组织中呈明显的下调表达,而IL-10、TLR4 mRNA和蛋白呈显著的上调表达,与正常对照组相比,表达水平差异均具有统计学意义(均为p5)。4.体外细胞转染实验发现,与EAU对照组、模拟剂阴性对照(mimic Negative,mimic N)组相比,加入rno-mir-30b-5p mimic干预的脾脏和淋巴结组的IL-10、TLR4的基因和蛋白出现明显的下调表达;经rno-mir-30b-5p inhibitor干预后,淋巴结组中IL-10、TLR4 mRNA显著上调表达(均为p5);脾脏组中,TLR4 mRNA为显著上调表达(p5),而IL-10mRNA的上调表达不明显(p>0.05);rno-mir-30b-5p inhibitor脾脏和淋巴结组中,IL-10、TLR4蛋白质的上调表达与EAU空白组、抑制剂阴性对照组(inhibitor

关键词：葡萄膜炎实验性自身免疫性葡萄膜炎 rno-mir-30b-5p IL-10 Toll Like Receptor4 T淋巴细胞

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祛风明目丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠TLR4/MyD88/NF-κb通路蛋白的影响

祛风明目丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通...

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作者：李桂芳湖南中医药大学

学位级别：硕士

目的:观察祛风明目丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠TLR4/My D88/NF-κb通路蛋白的影响,深入探讨祛风明目丸的疗效及作用机制。方法:将70只SpF级健康雄性Lewis大鼠随机分为空白对照组19只,模型组51只。模型组在IRbp的诱导下建立EAU大... 详细信息

目的:观察祛风明目丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠TLR4/My D88/NF-κb通路蛋白的影响,深入探讨祛风明目丸的疗效及作用机制。方法:将70只SpF级健康雄性Lewis大鼠随机分为空白对照组19只,模型组51只。模型组在IRbp的诱导下建立EAU大鼠模型,每日观察大鼠眼部的炎症情况,并参照Caspi 0-4分的标准进行炎症评分,在造模后第7天,从空白对照组和模型组大鼠中各随机抽取3只处死,取眼球制作病理切片,进行组织病理学检查。造模成功后将模型组按照随机数字表分为模型对照组、祛风明目丸低剂量组、祛风明目丸正常剂量组,每组16只。祛风明目丸低剂量组大鼠与正常剂量组大鼠每日以祛风明目丸悬浊液2g/Kg.d和4g/Kg.d灌胃14天,空白对照组、模型对照组每日以等量蒸馏水灌胃。实时荧光定量pCR检测脾脏及淋巴结组织中rno-mir-30b-5p、TLR4m RNA表达水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测脾脏及淋巴结组织中TLR4、My D88、NF-κb p65蛋白的表达水平。结果:***检测rno-mir-30b-5p、TLR4m RNA水平,结果显示:模型对照组rno-mir-30b-5p表达量明显低于空白组及祛风明目丸干预组(pp5);模型对照组大鼠TLR4m RNA表达量明显高于空白组及祛风明目丸正常剂量组(pp>0.05)。***检测EAU大鼠TLR4、My D88、NF-κb p65水平,结果显示:与空白组相比,模型对照组大鼠TLR4、My D88、NF-κb p65蛋白的表达水平明显高于空白组及祛风明目丸正常剂量组(pp>0.05),祛风明目丸低剂量与正常剂量组之间NF-κb p65蛋白表达差异有统计学意义(pmir-30b-5p能够负向调节TLR4基因的表达。***4/My D88/NF-κb传导通路参与自身免疫性葡萄膜炎的发生。3.祛风明目丸能够通过抑制TLR4/My D88/NF-κb传导通路来控制自身免疫性葡萄膜炎的发生发展,从而发挥治疗作用。

关键词：实验性自身免疫性葡萄膜炎祛风明目丸 rno-mir-30b-5p TLR4mRNA TLR4 MyD88 NF-κb p65

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