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微生物学通报 2015年第1期42卷 9-16页

作者：夏苗苗刘露班睿天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室天津300072

【目的】研究核黄素操纵子(rib)组成型高表达,以及rib C基因低水平表达对枯草芽孢杆菌过量合成核黄素的影响。【方法】在染色体原位修饰启动子,用m RNA稳定子替换m RNA前导区,使rib操纵子组成型高表达;修饰rib C基因的启动子,降低rib C... 详细信息

【目的】研究核黄素操纵子(rib)组成型高表达,以及rib C基因低水平表达对枯草芽孢杆菌过量合成核黄素的影响。【方法】在染色体原位修饰启动子,用m RNA稳定子替换m RNA前导区,使rib操纵子组成型高表达;修饰rib C基因的启动子,降低rib C基因的表达水平。采用q RT-PCR方法,表征基因的相对表达水平;通过摇瓶发酵,测定重组菌的生物量和核黄素产量,表征相关基因修饰所表现的遗传效应。【结果】用gsi B m RNA稳定子替换核黄素操纵子的m RNA前导区,使其相对表达水平提高了约1 500倍。rib C基因启动子-35区的首个碱基由"T"突变为"C",使rib C基因的表达水平下降了97%以上。得到的重组菌株LX34在补加蔗糖20 g/L的LB培养基上摇瓶发酵36 h,可积累核黄素2.1 g/L,同时生物量没有明显下降。【结论】使用gsi B m RNA稳定子,能够有效地提高目标基因或操纵子的表达水平;启动子-35区首个碱基的点突变,能够有效降低rib C基因的表达水平;rib操纵子过量表达和rib C基因低水平表达,使细胞能够过量合成并积累核黄素。

关键词：枯草芽孢杆菌核黄素 rib操纵子 ribc基因 mRNA稳定子

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枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径相关基因及ribc基因的遗传修饰

枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径相关基因及ribC基因的遗传修饰

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作者：刘露天津大学

学位级别：硕士

核黄素是一种B族维生素（VB2），作为临床药品、食品和饲料添加剂，具有广泛的应用。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有从无到有的核黄素合成途径，经过遗传改造的菌株，能够过量合成核黄素。枯草芽孢杆菌作为核黄素发酵生产菌，... 详细信息

核黄素是一种B族维生素（VB2），作为临床药品、食品和饲料添加剂，具有广泛的应用。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有从无到有的核黄素合成途径，经过遗传改造的菌株，能够过量合成核黄素。枯草芽孢杆菌作为核黄素发酵生产菌，已成功的应用于工业生产。目前使用的核黄素生产菌株，或多或少带有因诱变剂处理而形成的基因突变。某些未知的基因突变对菌种性能产生了不利影响，主要表现为生长延迟、生物量低等。诱变育种虽可获得核黄素高产菌株，但不能揭示核黄素的高产机理。本研究采用基因工程育种方法，对枯草芽孢杆菌的嘌呤核苷酸合成途径及核黄素转化反应相关的基因进行了遗传修饰，并考察了对核黄素过量合成的影响。以核黄素操纵子组成型表达菌株枯草芽孢杆菌LX20为出发菌，采用无标记基因修饰方法，敲除鸟苷单磷酸（GMP）还原酶基因（guaC），切断由GMP到次黄嘌呤核苷单磷酸（IMP）的逆反应，构建了重组菌株LX21。在此基础上，敲除腺苷琥珀酸合成酶基因（purA），切断由IMP合成腺苷单磷酸（AMP）的分支代谢途径，构建了guaC和purA双缺陷的重组菌株LX22。在菌株LX22中敲除嘌呤操纵子（pur operon）阻遏蛋白编码基因簇purR-yabJ，构建了pur操纵子转录起始去调控的重组菌株LX34。在菌株LX21中，采用同源重组方法，用氯霉素抗性基因替换pur操纵子的mRNA前导区，构建了pur操纵子缺陷的菌株LX23。再通过同源重组方式，用cryⅢA mRNA稳定子替换氯霉素抗性基因，恢复pur操纵子的功能，构建了菌株LX33。再敲除LX33菌株的purA和purR-yabJ，构建了菌株LX35。采用荧光定量PCR方法，检测胞内pur操纵子的mRNA相对水平。结果显示，菌株LX34较LX22平均提高了10.18倍;菌株LX35较LX22平均提高了53.33倍。结果表明，在枯草芽孢杆菌中，敲除purR-yabJ基因簇，同时用cryⅢA mRNA稳定子替换mRNA前导区，能够显著提高pur操纵子转录水平。分别在菌株LX22、LX34和LX35的ribc基因启动子-35区第一个碱基引入“T→C”突变，构建了菌株LX24、LX36和LX37。荧光定量PCR的分析结果显示，ribc基因启动子点突变使其转录水平下降到野生型的3%。摇瓶培养显示，purA、guaC、purR-yabJ和ribc基因的遗传修饰，不影响细胞的生长;嘌呤操纵子的组成型表达，导致菌株的生长延迟。ribc基因启动子点突变仅使核黄素产量提高约3倍，达到160mg/L。结果表明，仅减低ribc基因的表达水平，不足以充分限制核黄素的转化，不能替代编码序列点突变的效应。在ribc基因启动子点突变背景下，嘌呤操纵子组成型表达对核黄素合成的影响不能体现。

关键词：嘌呤操纵子嘌呤核苷酸合成途径 ribc基因核黄素枯草芽孢杆菌

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枯草芽孢杆菌核黄素合成途径相关基因的修饰

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作者：夏苗苗天津大学

学位级别：硕士

在枯草芽孢杆菌的核黄素合成代谢途径中，核黄素操纵子（rib）表达水平与核黄素激酶/FAD合成酶（ribc）活性，是影响核黄素过量合成的关键因素。本文研究了rib操纵子表达元件的修饰和mRNA稳定子替换的效应，以及ribc基因点突变对核黄素... 详细信息

在枯草芽孢杆菌的核黄素合成代谢途径中，核黄素操纵子（rib）表达水平与核黄素激酶/FAD合成酶（ribc）活性，是影响核黄素过量合成的关键因素。本文研究了rib操纵子表达元件的修饰和mRNA稳定子替换的效应，以及ribc基因点突变对核黄素过量合成的影响。首先采用DNA片段和质粒原生质体转化方法，对***24A1菌株的基因重组能力进行了检验，发现其在原生质体状态下没有同源重组能力，或者重组率低于4×10-3，不适合作为基因修饰的出发菌株。以***30为出发菌，通过氯霉素抗性基因与rib操纵子启动子区的双交换重组，构建了核黄素缺陷株***31，作为rib操纵子表达元件进一步修饰的出发菌。通过同源重组方式，分别构建了rib操纵子启动子-35区consensus化修饰，mRNA前导区被gsiBmRNA稳定子替换的重组菌株***32;以及rib操纵子启动子-35区consensus化修饰，mRNA前导区被asnHmNRA稳定子替换的重组菌***33。采用qRT-PCR方法检测重组菌胞内rib操纵子转录的mRNA水平，发现使用gsiBmRNA稳定子修饰的rib操纵子，其mRNA水平相对出发菌提高1531倍;使用asnHmNRA稳定子修饰的rib操纵子，其mRNA水平相对出发菌提高9倍。结果表明，rib操纵子启动子-35区consensus化修饰，以及采用gsiBmRNA稳定子替换mRNA前导区，能够使rib操纵子组成型高表达。用带有***24A1突变型ribc基因及红霉素抗性标记的重组质粒，转化菌株LX32，在抗性平板上筛选得到了黄色菌落LX34。经测序验证，发现LX34菌株ribc基因的启动子-35区第一个碱基发生了T→C点突变。摇管发酵显示，LX34菌株培养36h，核黄素产量达到2.13g/L，高于24A1菌株1.94g/L的产量，且菌株LX34的生长能力优于24A1。结果表明，ribc基因启动子-35区的T→C点突变，其遗传效应与编码序列的G596A突变相当，可以使核黄素过量合成。

关键词： rib操纵子 ribc基因 gsiBmRNA稳定子 asnHmRNA稳定子核黄素枯草芽孢杆菌

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