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作者：毛争争华中农业大学

学位级别：硕士

resilin-R5融合蛋白是将天然超强弹性蛋白resilin和硅沉积肽R5线性连接形成的人工嵌段高分子。其中,resilin是一类具备超强弹性的生物蛋白,在一些昆虫外骨骼,飞行系统,发声系统等有着广泛的分布,交联后的resilin所具备的超高弹性以及变... 详细信息

resilin-R5融合蛋白是将天然超强弹性蛋白resilin和硅沉积肽R5线性连接形成的人工嵌段高分子。其中,resilin是一类具备超强弹性的生物蛋白,在一些昆虫外骨骼,飞行系统,发声系统等有着广泛的分布,交联后的resilin所具备的超高弹性以及变性复原能力要远远高于普通橡胶,在材料学、医学和组织工程等领域具备很高的潜在应用价值。R5肽来自硅藻(Cylindrotheca fusiformis)细胞壁中silaffin前体多肽C端的由19个氨基酸构成的功能单位,能够诱导和调节硅藻中二氧化硅的沉积作用。其所展示的体外二氧化硅沉积性能,能获得具有不同形态学特征的拱形结构和细长纤维结构,暗示了其在纳米材料等领域的潜在应用价值。本论文为了获得兼具“高弹性”和“硅沉积”性能的新型功能生物材料,将具有高弹性的resilin蛋白与具有硅沉积作用的R5肽进行了融合,研究了其在大肠杆菌中的表达,及纯化方法。首先,将果蝇弹性蛋白基因CG15920序列与硅藻R5肽基因序列进行拼接,经过稀有密码子优化后合成重组基因resilin-r5。然后将其插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS获得表达菌株,并通过IPTG进行诱导表达。同时将resilin-r5插入到载体pUC57后转化***, E. coli BW25113, *** DH5a等大肠杆菌菌株比较不同菌株的表达差异,以期获取更高的目标蛋白表达量。最后以盐析加热法和Ni离子柱亲和层析法纯化带组氨酸标签的重组融合蛋白。最终实现resilin-R5融合蛋白的高效表达,产量达到120mg/L发酵液。并采用6×His标签Western blot和蛋白质C端测序,证实所获得融合蛋白为全长目标蛋白resilin-R5。进一步将resilin-R5与天然阳性多糖-壳聚糖按一定比例共混,制备了系列resilin-R5/壳聚糖共混复合膜材料。对复合膜材料的溶胀性能、透气性、吸水率、保水率、光催化交联性能、二氧化硅沉积性能和力学性能进行了测试;并采用傅立叶变换红外光谱分析、差示扫描量热分析和显微观察对复合膜内部基团间相互作用、共混性能和膜形貌进行了测试分析。结果表明,伴随resilin-R5比例升高,复合膜溶胀比呈逐步下降趋势,最低溶胀比约为纯壳聚糖膜的50%;当resilin-R5比例分别为7%和33%时复合膜透气性较高,分别达到403g/m2·24h和392g/m2·24h,均显著高于纯壳聚糖膜;复合膜的吸水率和保水率伴随resilin-R5比例升高呈升高趋势,最高分别达到264%和231%,均显著高于纯壳聚糖膜;复合膜形貌表现为多微球聚集膜材料,经光催化后能够形成紫外下发射蓝色荧光的交联体,并能催化硅酸甲酯水解在膜表面或内部形成颗粒状沉积物;当resilin-R5比例为13%时,复合膜具有最高拉伸长度和最高拉断强度,分别为41.6%和32.1MPa,显著高于纯壳聚糖;傅立叶变换红外光谱和差示扫描量热分析结果表明,resilin-R5与壳聚糖间存在相互作用,且当resilin-R5比例低于20%时,resilin-R5与壳聚糖间具有良好的共混性能。综上所述,本文设计合成了resilin-r5融合基因,并在大肠杆菌中实现了高效表达和纯化,创制了resilin-R5这一新型蛋白质类生物材料;resilin-R5/壳聚糖复合膜具有优良的材料学性能,在医用敷料和缝合线方面具有良好的应用潜力。

关键词： resilin R5肽原核表达蛋白纯化壳聚糖复合生物材料

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重组resilin蛋白源水凝胶的制备及其在心肌组织工程中的应用

重组Resilin蛋白源水凝胶的制备及其在心肌组织工程中的应用

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作者：赵乐北京交通大学

学位级别：硕士

心肌梗死在我国具有很高的发病率和死亡率。心梗后心肌细胞死亡,由于心脏再生能力极其有限,依靠其自身修复机制无法弥补损失的心肌细胞,梗死心肌组织纤维化及残存心肌的代偿性肥大进一步使患者发展为心力衰竭,进而导致死亡。现有治疗手... 详细信息

心肌梗死在我国具有很高的发病率和死亡率。心梗后心肌细胞死亡,由于心脏再生能力极其有限,依靠其自身修复机制无法弥补损失的心肌细胞,梗死心肌组织纤维化及残存心肌的代偿性肥大进一步使患者发展为心力衰竭,进而导致死亡。现有治疗手段虽能在一定程度上缓解患者症状,但不能从根本上解决缺血后心肌损伤修复的难题,从而无法抑制心梗后负性心室重构,终将导致心衰。可注射性心肌组织工程策略,即以可注射性水凝胶材料为载体携带细胞和/或生长因子注射到心肌损伤部位进行损伤修复,有望成为除药物、血运重建术、心脏移植以外新的治疗手段。近年来,随着心肌组织工程可注射性水凝胶材料相关研究的不断深入,具有良好生物相容性的弹性材料逐渐受到研究人员的关注。研究表明,弹性水凝胶材料不仅可以作为携带细胞、生长因子等目标物质的载体,还因具备良好的弹性和可拉伸性,能够为心肌组织提供机械性辅助并改善梗死组织的力学微环境,从而改善梗死组织局部心肌运动障碍、降低室壁应力,有利于损伤部位的修复和心脏功能的改善。节肢弹性蛋白(resilin)是一种在昆虫节肢中发现的弹性蛋白,因其表现出显著的弹性、回弹性以及抗疲劳性等特点而备受关注。自鉴定出第一个resilin蛋白的基因序列以来,人们已经设计出多种基于resilin序列的重组序列并构建出多种resilin样蛋白,已成功应用于组织工程与药物递送领域,尤其在血管、声带、软骨和肌肉等组织工程研究中进展迅速。在重组resilin蛋白源弹性材料研究中,基于RLP12蛋白的resilin水凝胶材料的因具有良好的力学性能和生物活性近年来备受关注。RLP12蛋白是在resilin核心弹性序列的基础上添加了细胞结合域,因此其交联形成的水凝胶能够表现出优异的细胞粘附性以及促细胞增殖的能力,并对声带损伤具有修复作用。然而,在可注射性心肌组织工程中,resilin样蛋白来源的水凝胶是否能够作为干细胞的可注射载体用于梗死心肌的损伤修复尚不明确。本研究首先通过基因工程方法构建不同的重组resilin蛋白表达载体,经诱导表达和纯化后分别获得resilin样蛋白rec1-resilin以及RLP12,并利用化学交联法制备基于RLP12蛋白的resilin水凝胶材料;在此基础上,以RLP12源resilin水凝胶为载体携带红色荧光蛋白标记的BADSCs进行大鼠心梗移植,对其心梗损伤修复能力进行深入研究,验证RLP12源resilin水凝胶携带BADSCs心梗注射进行心肌损伤修复的可行性与效果。本论文主要包含以下两部分研究内容:第一部分:resilin样蛋白源水凝胶材料的制备目的:制备resilin样蛋白源水凝胶并对其力学性能进行测定。方法:构建两种重组resilin蛋白表达载体RLP12与rec1-resilin并对其进行诱导表达与纯化;利用化学交联法制备出基于RLP12蛋白的resilin水凝胶材料,并通过振荡剪切流变特性检测试验对其力学性能进行鉴定。结果:成功构建了重组resilin蛋白表达载体RLP12与rec1-resilin,诱导表达纯化后分别获得RLP12蛋白与rec1-resilin蛋白;利用THP交联获得了3种不同PEG含量的RLP12-resilin水凝胶,振荡剪切流变特性检测结果表明其剪切模量为10k Pa-15k Pa。结论:成功制备了RLP12蛋白与rec1-resilin蛋白并获得了基于RLP12蛋白的resilin水凝胶材料。第二部分:以resilin水凝胶为载体携带棕色脂肪源干细胞(BADSCs)心梗移植的心肌损伤修复研究目的:验证resilin样蛋白水凝胶材料作为干细胞可注射性载体用于梗死心肌损伤修复的可行性与效果。方法:以RLP12蛋白源resilin水凝胶为载体携带红色荧光蛋白标记的BADSCs进行大鼠心梗移植,通过心脏超声对移植4周后心脏功能进行测定;通过组织学、免疫组织化学染色、免疫荧光染色等方法对心梗面积、胶原沉积、微血管密度、BADSCs体内存活与分化进行检测。结果:RLP12源resilin水凝胶作为BADSCs的载体,能显著提高BADSCs在心肌组织中存活;移植4周后可以显著改善心梗大鼠的心脏功能、减少心梗面积、降低纤维沉积水平并提高微血管密度;RLP12源resilin水凝胶能够提高Ⅲ型胶原在心梗区域与心梗边缘区域的分布水平。此外,RLP12源resilin水凝胶能够提高BADSCs在体内向c Tn T阳性细胞、α-SMA阳性细胞的分化能力。结论:RLP12源resilin水凝胶能够作为干细胞的可注射性载体用于心肌梗死的治疗,其可能通过改善心梗部位力学微环境增加Ⅲ型胶原的分布,进而提高心肌组织的顺应性。本研究首次以RLP12源resilin水凝胶为载体携带棕色脂肪源干细胞进行大鼠心梗移植,实现了抑制心梗后负性心室重塑、提高心

关键词： resilin 可注射性水凝胶心肌组织工程棕色脂肪源干细胞心肌梗死

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Micro/nano-scale Characterization and Fatigue Fracture Resistance of Mechanoreceptor with Crack-shaped Slit Arrays in Scorpion

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Journal of Bionic Engineering 2019年第3期16卷 410-422页

作者： Kejun Wang Junqiu Zhang Yuqiang Fang Daobing Chen Linpeng Liu Zhiwu Han Luquan Ren Key Laboratory for Bionic Engineerings Ministry of Education Jilin University Changchun 130022 China School of Mechanical and Aerospace Engineering Jilin University Changchun 130022 China

The nocturnal scorpion Heterometrus petersii uses Basitarsal Compound Slit Sensilla (BCSS) as mechanoreceptor to detect mechanical signal (e.g. substrate vibration, cyclic loads caused by walking) without fatigue failure such as initiation of fatigue crack and further propagation of crack-shaped slit. The outstanding perceptive function has been discovered for over half a century. However, it is not yet clear about the microstructure, material composition and micromechanical property which are all important factors that determine the fatigue fracture resistance of the BCSS. Here, the microscopic characteristics of the BCSS were thoroughly studied. The results dicate that anti-fatigue resilin and stiff chitinous cuticle form multilayered composite as the main body of the BCSS. Meanwhile, the pre-existing slit as mechanosensory structure is covered by cuticular membrane which has different mechanical property with the epicuticle. Theoretical analysis shows that the structure-composition-property synergistic relations of composites confer on the BCSS with extreme fatigue fracture tolerance.

关键词： slit-based mechanoreceptor materials characterization multilayered composite resilin fatigue fracture resistance

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The Role of Soft Vein Joints in Dragonfly Flight

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Journal of Bionic Engineering 2017年第4期14卷 738-745页

作者： Dan Hou Zheng Zhong Yajun Yin Yihui Pan Hongxiao Zhao Department of Mechanical Engineering Shanghai Maritime University Shanghai 201306 China School of Aerospace Engineering and Applied Mechanics Tongji University Shanghai 200092 China College of Science Harbin Institute of Technology Shenzhen 518055 China Department of Engineering Mechanics Tsinghua University Beijing 100084 China

Dragonflies are excellent flyers among insects and their flight ability is closely related to the architecture and material properties of their wings. The veins are main structure components of a dragonfly wing, which are found to be connected by resilin with high elasticity at some joints. A three-dimensional （3D） finite element model of dragonfly wing considering the soft vein joints is developed, with some simplifications. Passive deformation under aerodynamic loads and active flapping motion of the wing are both studied. The functions of soft vein joints in dragonfly flight are concluded. In passive deformation, the chordwise flexibility is improved by soft vein joints and the wing is cambered under loads, increasing the action area with air. In active flapping, the wing rigidity in spanwise direction is maintained to achieve the required amplitude. As a result, both the passive deformation and the active control of flapping work well in dragonfly flight. The present study may also inspire the design of biomimetic Flapping Micro Air Vehicles （FMAVs）.

关键词： dragonfly wing resilin soft vein joint bionics and mechanics flapping micro air vehicles

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