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多杀性巴氏杆菌毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用

多杀性巴氏杆菌毒素单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用

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作者：佟佳音南京农业大学

学位级别：硕士

产毒素型多杀性巴氏杆菌（Toxigenic Pasteurella multocida,T+Pm）是一种两极着染的革兰氏阴性短杆菌,是畜禽一种重要的病原菌。该菌感染不仅可导致多种动物发病,也可感染人。猪进行性萎缩性鼻炎（progressive atrophic rhinitis,PAR... 详细信息

产毒素型多杀性巴氏杆菌（Toxigenic Pasteurella multocida,T+Pm）是一种两极着染的革兰氏阴性短杆菌,是畜禽一种重要的病原菌。该菌感染不仅可导致多种动物发病,也可感染人。猪进行性萎缩性鼻炎（progressive atrophic rhinitis,PAR）主要由T+Pm引发,其对猪鼻甲骨造成的损害不可逆转。自19世纪30年代人们首次发现Pm后,其已在养猪业发达的各个国家和地区广泛流行。由于它可与多种病原菌协同作用,从而导致猪群呼吸道疾病的发病率和死亡率也随之上升。T+Pm的ToxA基因编码的可分泌的多杀性巴氏杆菌毒素（Pasteurella multocida toxin,PMT）是诱发PAR的主要原因之一。通过单独接种PMT,可以在实验猪中完整的复制PAR的症状。它抑制成骨细胞分化并促进骨骼再生,从而介导PAR。目前诊断PAR的方法,主要是针对PMT抗体的检测。但由于PMT全蛋白不稳定和易降解的特性,对于后续试剂盒的开发影响很大。早在1991年,Petersen和Nielsen等人通过截短表达不同长度的PMT探究其免疫原性。结果表明PMT的c端是其免疫原性的主要组成部分。所以本研究采用截短表达rpmt-c端蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体从而建立PMT抗体的阻断ELISA方法。具体研究如下:***-c端截短蛋白单克隆抗体的制备本研究采用实验室建立好的含质粒pET32a-toxc的大肠杆菌,经过复苏后进行大量表达纯化得到rpmt-c端蛋白,经弗氏佐剂乳化后免疫6只BALB/c小鼠。经3次免疫后通过间接ELI S A方法筛选出抗体效价最高的小鼠进行冲击免疫。使用该小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合以及3次亚克隆之后,制备出9株可以稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株。分别命名为 3E3、4H2、7A3、4H6、11B2、9G1、12F4、8G5和6A3。上清效价分别为 1:12800、1:12800、1:6400、1:12800、1:12800、1:3200、1:1600、1:800和1:6400。叠加ELISA结果表明9株单抗针对的抗原表位相同。进一步Western blot结果显示rpmt-c端蛋白可与单抗3E3上清发生反应,表明特异性良好。3E3单抗10代内稳定性良好。亚型鉴定结果表明单抗3E3属于IgG1亚类,轻链为κ链。将单抗3E3杂交瘤细胞腹腔注射提前一周用灭菌液体石蜡处理的小鼠制备腹水,测得效价为1:102400。将采集好的腹水委托钟鼎生物公司进行纯化和HRP标记,得到可以与rpmt-c端蛋白特异性反应的酶标记单克隆抗体。2.多杀性巴氏杆菌毒素阻断ELISA检测方法及初步应用本研究应用重组的rpmt-c端蛋白为包被抗原,以HRP标记的3E3单抗为检测抗体,通过条件优化,建立了多杀性巴氏杆菌毒素抗体的阻断ELISA检测方法。经过实验优化得到的条件为:2μg/mL的抗原包被浓度;封闭液为2%的BSA,封闭时间37℃、3h;待测样品最佳稀释比1:1,37℃孵育0.5h;酶标单抗作用时间为37℃、0.5h,其最佳稀释浓度为1:2000;最佳显色时间10min。使用该方法对临床50份PMT阴性血清进行检测并统计分析,使用该检测方法检测血清,当PI≥51.51%判定结果为阳性;当PI≤44.89%判定结果为阴性;当44.89%＜PI＜51.51%时,判定结果为可疑。应用该方法对临床74份已经通过间接ELISA检测确定阳性的样品进行检测,可知阻断ELISA的敏感性为90.5%;使用该方法检测临床HPS、Bb、APP、ASFV、PRV、PcV2、PRRSV、cSFV 阳性猪血清后计算得到PI值均≤44.89%,说明该方法特异性优良。批内与批间重复实验,经计算cV均小于10%。由此可见该检测方法特异性好、灵敏度高且重复性强。应用该方法对实验室保存的部分华东六省一市猪场的血清进行检测,阳性率为16.16%。其中福建省某猪场检测阳性率高达76.47%,表明我国仍存在较为严重的猪群T+Pm感染情况。综上,rpmt-c端蛋白单抗的制备以及后续阻断ELISA检测方法的建立对于临床上快速大量检测T+Pm感染的猪群有很大的意义,也为后续PAR的防控和净化提供了重要的科学支持。

关键词：猪进行性萎缩性鼻炎产毒素型多杀性巴氏杆菌 rpmt-c端蛋白单克隆抗体阻断ELISA

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