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BHK-21细胞悬浮培养狂犬病病毒(rcvs-11-dg株)工艺的建立及病毒免疫原性评价

中国生物制品学杂志 2021年第2期34卷 129-134页

作者：李政蓉金宏丽黄培刘川玉王化磊赵永坤赵健石晶杨松涛夏咸柱吉林大学动物医学学院吉林长春130062 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 长春西诺生物科技有限公司吉林长春130012

目的优化生物反应器悬浮批次培养狂犬病病毒(rcvs-11-dg株)工艺,制备灭活免疫原,并检测其免疫原性。方法摇瓶培养BHK-21细胞,优化rcvs-11-dg株病毒培养温度、接种MOI及接毒时初始细胞密度等病毒培养条件,使病毒与细胞相互适应,提高病毒... 详细信息

目的优化生物反应器悬浮批次培养狂犬病病毒(rcvs-11-dg株)工艺,制备灭活免疫原,并检测其免疫原性。方法摇瓶培养BHK-21细胞,优化rcvs-11-dg株病毒培养温度、接种MOI及接毒时初始细胞密度等病毒培养条件,使病毒与细胞相互适应,提高病毒滴度,为生物反应器培养病毒提供参数。在5 L体积的生物反应器中,低血清悬浮培养BHK-21细胞,稀释传代并接毒,确定细胞培养阶段最适传代时间、病毒培养阶段最适收毒时间,利用优化后条件培养病毒,收获的病毒液经β-丙内酯灭活后,分别加入Gel(02)、PCP-2及铝胶佐剂,制备免疫原,分单次和2次免疫BALB/c小鼠,荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibody virus neutralization,FAVN)检测小鼠血清抗体效价。结果 rcvs-11-dg株狂犬病病毒在摇瓶中的最适培养条件为温度34℃,接种MOI=0.01,接毒初始细胞密度3×106个/mL,接毒后48 h病毒滴度可达2×108.25TCID50/mL。生物反应器中病毒最适培养条件为温度34℃,DO 40%,MOI=0.01,搅拌120 r/min,pH 7.4,接毒后108 h病毒滴度可达2×109 TCID50/mL。病毒液灭活后混合不同佐剂免疫小鼠,单次和2次免疫组小鼠首免后14 d抗体效价均高于0.5 IU/mL,2次免疫组小鼠免疫后28、42 d抗体水平均高于单次免疫组。结论应用生物反应器培养工艺制备的灭活免疫原的病毒滴度高于摇瓶培养工艺,免疫小鼠后能产生高效价的中和抗体。本研究为生物反应器规模化生产狂犬病病毒及其灭活疫苗制备工艺的改进奠定了基础。

关键词： BHK-21细胞生物反应器悬浮培养狂犬病病毒 rcvs-11-dg株免疫原性

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狂犬病病毒rcvs-11-dg株悬浮培养工艺的建立及其免疫原性研究

狂犬病病毒rCVS-11-dG株悬浮培养工艺的建立及其免疫原性研究

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作者：李政蓉吉林大学

学位级别：硕士

狂犬病病毒属于弹状病毒科病毒,该病毒具有严格的嗜神经性,感染人及犬、猫等几乎所有温血动物。人狂犬病主要由带毒犬、猫等动物咬伤、抓伤所致,感染后表现出恐水、畏光和吞咽困难等临床症状,病死率几乎为100%。因此,消除动物狂犬病是... 详细信息

狂犬病病毒属于弹状病毒科病毒,该病毒具有严格的嗜神经性,感染人及犬、猫等几乎所有温血动物。人狂犬病主要由带毒犬、猫等动物咬伤、抓伤所致,感染后表现出恐水、畏光和吞咽困难等临床症状,病死率几乎为100%。因此,消除动物狂犬病是预防控制人狂犬病的关键手段。实践证明,动物接种疫苗后能有效预防狂犬病病毒的传播与感染,因此研制安全有效的兽用疫苗至关重要。自从2012年国家农业部发布公告停止受理转瓶工艺的兽用细胞疫苗生产线项目的兽药GMP验收申请后,使用生物反应器生产疫苗已经成为行业发展的必然选择。本研究利用BHK-21细胞悬浮培养rcvs-11-dg株狂犬病病毒,通过优化培养条件和培养工艺,提高病毒滴度和产量,并进行实验免疫研究,以期为BHK-21细胞规模化培养狂犬病病毒生产工艺的建立和研发安全高效价狂犬病灭活疫苗奠定基础。1.利用BHK-21细胞在摇瓶中悬浮培养rcvs-11-dg株狂犬病病毒。通过对温度、接种量、接毒时初始细胞密度、收获时间等变量条件下病毒滴度的测定,确定rcvs-11-dg株狂犬病病毒的最佳培养条件。实验表明,在34℃,摇瓶转速为130 r/min,添加1%的胎牛血清和1%抗真菌抗生素,CO含量为5%的条件下进行rcvs-11-dg株悬浮培养,细胞密度3×10个/mL时接种MOI=0.01,培养60h,病毒滴度可以达到2×10TCID/mL。2.利用BHK-21细胞在生物反应器中悬浮培养rcvs-11-dg株狂犬病病毒。参考摇瓶培养的数据,利用生物反应器放大培养,重复培养3次,并摸索生物反应器的转速和通气方式对细胞培养的影响。由此确定最佳培养条件。实验表明,细胞传代时间为60 h。(34±0.1)℃,DO 40%,MOI=0.01,搅拌120 r/min、pH 7.4±0.1,在初始细胞密度为3×10个/mL的条件下接种病毒,最佳的收毒时间为108 h,病毒滴度最高可达2×10TCID/mL。3.小鼠实验免疫研究:悬浮培养收获的病毒经灭活,加不同佐剂后免疫小鼠,利用FAVN方法测定免疫后血清中和抗体效价,应用国际通用标准(中和抗体效价是否大于0.5 IU/mL)评价该病毒的免疫原性。单次免疫组和2次免疫组首免后14 d抗体效价均大于0.5 IU/mL,且2次免疫组小鼠免疫后28、42 d抗体水平均高于单次免疫组。不同佐剂组中,Gel(02)免疫佐剂可以更好的增强rcvs-11-dg株的免疫原性。通过上述研究,摸索了rcvs-11-dg株狂犬病病毒在BHK-21细胞中利用摇瓶和生物反应器悬浮培养的最佳反应条件,初步确定了rcvs-11-dg株生物反应器悬浮培养工艺;应用生物反应器培养rcvs-11-dg株的病毒滴度高于摇瓶培养,该方法培养条件易于控制,产量高并节约成本;所培养的病毒灭活后制备免疫原免疫小鼠能产生大于0.5 IU/mL的高效价的中和抗体。本研究为生物反应器规模化生产狂犬病病毒及其灭活疫苗制备工艺的改进奠定了基础。

关键词： BHK-21细胞生物反应器悬浮培养狂犬病病毒 rcvs-11-dg株免疫原

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