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基因重组去整合素radinbitor对C6神经胶质瘤细胞FAK-Ras/MAPK通路的影响

生物化学与生物物理进展 2009年第6期36卷 702-708页

作者：赵霆李金萍胡燕荣洪艳赵宝昌大连医科大学生物化学与分子生物学教研室大连116044

radinbitor为大连医科大学生物化学与分子生物学教研室从旅顺产白眉蝮蛇毒腺中采用克隆技术得到的去整合素.之前研究已证明radinbitor具有抑制C6神经胶质瘤细胞增殖、促进C6神经胶质瘤细胞凋亡的作用.radinbitor对C6细胞作用的分子机制... 详细信息

radinbitor为大连医科大学生物化学与分子生物学教研室从旅顺产白眉蝮蛇毒腺中采用克隆技术得到的去整合素.之前研究已证明radinbitor具有抑制C6神经胶质瘤细胞增殖、促进C6神经胶质瘤细胞凋亡的作用.radinbitor对C6细胞作用的分子机制需要进一步研究.在此研究中,用***21/pET23b-adinbitor表达radinbitor,通过Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析柱对radinbitor进行纯化,纯化蛋白经Western blotting鉴定.用纤连蛋白(fibronectin,FN)诱导C6细胞.通过免疫沉淀和免疫印迹检测不同浓度的radinbitor对FN诱导的C6细胞中黏着斑激酶(FAK)、MEK1/2、Caspase-3的表达以及对FAK、ERK1/2活性的影响.研究表明:各实验组不同浓度的radinbitor均能明显降低FAK、MEK1/2的表达,对Caspase-3的表达起促进作用,并对ERK1/2的磷酸化有明显的抑制作用;除10mg/Lradinbitor对FAK磷酸化无明显抑制作用外,其余浓度的radinbitor对FAK的磷酸化起了明显抑制作用.这说明radinbitor对FAK及其下游Ras-MAPK传导通路的抑制在其抑制C6增殖过程中起了重要作用,Caspase-3表达升高提示,radinbitor可能通过抑制ILK及其下游的PI-3K/Akt途径起到了促进细胞凋亡的作用.

关键词：白眉蝮蛇去整合素 radinbitor C6神经胶质瘤细胞纤连蛋白(FN)

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radinbitor, a novel disintegrin from Agkistrodon halys brevicaudus stejneger inhibits adhesion and proliferation of SMMC-7721 cells

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The Chinese-German Journal of Clinical Oncology 2008年第7期7卷 390-393页

作者： Chunling Zhao Xiuyun Cui Feng Ren Baochang Zhao Department of Biochemical and Molecular Biology Dalian Medical University Dalian 116027 China

Objective： To investigate the effects of radinbitor on the adhesion and proliferation of human hepatoma cell strain 8MMC-7721. Methods： Cell adhesion assay was used to observe the effect of radinbitor on the adhesion of 8MMC-7721 cells to fibronectin （FN）. Crystal violet staining was performed to detect the influence of radinbitor on the adhesion of 8MMC- 7721 cells. MTT assay was employed to detect the inhibitory effects of different concentration of radinbitor on the proliferation of 8MMC-7721 cells. The morphologic changes of the control 8MMC-7721 cells and the apoptotic cells induced by 200μg/mL radinbitor for 36 h were observed under light microscope after HE staining. Flow cytometry analysis was applied to determine the apoptosis rate of 8MMC-7721 cells. Results：（1） FN promoted the adhesion of human hepatoma cell strain 8MMC-7721 in a dose-dependent manner. （2） radinbitor could dose-dependently inhibit the adhesion of SMMC-7721 cells to FN. The higher the concentration was, the stronger the inhibition was. There was significant difference among the groups （P 〈 0.05）. （3） radinbitor had a strong inhibition on the proliferation of 8MMC-7721 cells and showed a dose-dependent manner （P 〈 0.05）. After a 48 h exposure, the IC50 value of radinbitor was 177.83 μg/mL. （4） After exposure of 8MMC-7721 cells to 200μg/mL radinbitor for 36 h, the early morphologic changes appeared and the apoptosis rate was 20.68%, significantly higher than that of the control group （2.38%, P 〈 0.05）. Conclusion： radinbitor can dose-dependently inhibit the 8MMC-7721 cells adhesion to FN, and can inhibit the proliferation in dose-dependent manner and promote their apoptosis.

关键词： radinbitor disintegrin hepatoma adhesion proliferation apoptosis

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radinbitor通过CRKI介导的信号通路调控小鼠肝癌Hca-P细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭能力

rAdinbitor通过CRKI介导的信号通路调控小鼠肝癌Hca-P细胞的增殖...

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作者：孟隆隆大连医科大学

学位级别：硕士

背景:蛇毒去整合素(disintegrin)大部分富含半胱氨酸,分子量约5-9 k Da,其典型特征是含有RGD(Arg-Gly-Asp)或KGD(Lys-Gly-Asp)模体。大部分整合素识别RGD序列,而大多数细胞外基质都含RGD序列,因此RGD成为细胞外基质与细胞整合素结合的... 详细信息

背景:蛇毒去整合素(disintegrin)大部分富含半胱氨酸,分子量约5-9 k Da,其典型特征是含有RGD(Arg-Gly-Asp)或KGD(Lys-Gly-Asp)模体。大部分整合素识别RGD序列,而大多数细胞外基质都含RGD序列,因此RGD成为细胞外基质与细胞整合素结合的重要位点。去整合素通过与细胞外基质竞争性结合细胞表面的整合蛋白受体来阻断肿瘤细胞与细胞外基质的黏附,而发挥抑制肿瘤作用。r Adinbitor为本组从旅顺白眉蝮蛇毒腺中获得的由73个氨基酸残基(含12个半胱氨酸残基)组成的重组蛋白,含去整合素的典型RGD模体。前期结果表明,r Adibitor能抑制C6胶质瘤、B16黑色素瘤、胃癌、肝癌细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭以及血管新生能力,促进细胞凋亡。然而,r Adibitor作用于肿瘤细胞的分子机制尚不清楚。本论文研究r Adinbitor对鼠肝癌低淋巴道转移力Hca-P细胞的增殖、黏附、迁移、侵袭及凋亡的影响及相关分子机制。Hca-P是小鼠肝癌腹水型细胞,具有一定的淋巴结转移潜能,是研究肿瘤淋巴道转移的理想细胞模型。接头蛋白CRK作为一种癌基因产物发现于禽类肉瘤病毒CT10(chicken tumor 10)中,由SH2和SH3结构域组成,包括CRKI、CRKII和CRKL三个成员。CRK家族通过酪氨酸激酶和小G蛋白等信号分子来调控细胞转录、骨架重组及增殖、分化和凋亡等。CRKI是CRK家族成员,分子量为28 k Da,编码202个氨基酸,含1个SH2和1个SH3结构域。大量研究表明CRKL和CRKII异常表达与肿瘤发生发展有密切联系,而CRKI与肿瘤关系研究较少。本论文通过在小鼠肝癌Hca-P中过表达CRKI,研究其对细胞增殖、黏附、迁移和侵袭能力的影响,探讨其所作用的分子调控机制及其与r Adinbitor调控机制的内在联系。目的:1.探讨r Adinbitor对Hca-P细胞增殖、黏附、迁移、侵袭能力的抑制及分子机制。2.探讨CRKI过表达对Hca-P细胞增殖、黏附、迁移、侵袭能力的影响。3.探讨r Adinbitor调控的信号通路与CRKI作用分子机制间联系。方法:1.金属离子螯合层析纯化r Adinbitor;***-8法检测r Adinbitor对Hca-P毒性、Hoechst33258法检测细胞凋亡、Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力、小鼠淋巴结黏附实验检测细胞黏附能力;*** Blot法检测r Adinbitor作用于Hca-P细胞后,对CRK/DOCK180/Rac、MEK/ERK和PI3K/Akt/m TOR通路中信号分子表达水平影响;*** blot检测CRKI蛋白过表达水平;5.台盼蓝计数法检测CRKI过表达Hca-P的增殖能力、Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力、小鼠淋巴结黏附实验检测细胞黏附能力、台盼蓝拒染实验检测饥饿处理的细胞生存活力;6.小鼠足垫种植实验检测CRKI过表达对Hca-P体内足垫成瘤能力和淋巴结转移能力的影响。结果:1.r Adinbitor纯度均一;2.r Adinbitor对Hca-P增殖具有抑制作用,随药物浓度增加而增加;r Adinbitor对Hca-P作用48h的IC50值0μM;r Adinbitor剂量依赖性促进Hca-P凋亡;r Adinbitor明显抑制Hca-P迁移和侵袭能力;r Adinbitor对Hca-P淋巴结黏附能力具明显抑制作用;3.r Adinbitor作用Hca-P后,CRK/DOCK180/Rac、MEK/ERK和PI3K/Akt/m TOR通路中信号分子表达水平有不同程度降低,随药物浓度增加,下降程度愈加明显;4.稳定转染的单克隆细胞中CRKI表达水平明显提高;***过表达显著促进Hca-P的体外增殖、迁移、侵袭、淋巴结黏附能力和生存活力;***过表达显著促进Hca-P体内足垫成瘤和淋巴结转移能力。结论:1.r Adinbitor抑制Hca-P增殖并促其凋亡,IC50约40μM;2.r Adinbitor抑制Hca-P体外黏附、迁移和侵袭能力;3.r Adinbitor通过调控CRK/DOCK180/Rac、MEK/ERK和PI3K/Akt/m TOR信号通路中相关分子表达影响Hca-P的恶性行为;***过表达促进Hca-P增殖、黏附、迁移、侵袭及生存能力;***过表达能显著促进小鼠足垫成瘤和淋巴结转移能力;6.r Adinbitor通过CRKI介导的信号通路来调控Hca-P增殖、黏附、迁移和侵袭能力。

关键词：肝癌 Hca-P radinbitor CRKI

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radinbitor的抗肿瘤作用及其机制研究

rAdinbitor的抗肿瘤作用及其机制研究

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作者：刘雪梅大连医科大学

学位级别：硕士

目的：研究源于白眉蝮蛇的去整合素radinbitor的抗肿瘤作用,并探讨其抑制肿瘤生长作用的机制,为其以后的临床试验提供必要的实验和理论依据。方法：大量培养含有前期已构建好的radinbitor基因的***21,超声破碎细菌后,提取菌体总蛋白,利... 详细信息

目的：研究源于白眉蝮蛇的去整合素radinbitor的抗肿瘤作用,并探讨其抑制肿瘤生长作用的机制,为其以后的临床试验提供必要的实验和理论依据。方法：大量培养含有前期已构建好的radinbitor基因的***21,超声破碎细菌后,提取菌体总蛋白,利用His-BindColumn亲和层析技术对radinbitor进行纯化。用18%Tricine-SDS-PAGE对提取的总蛋白和纯化后的radinbitor进行鉴定。将80只BALB/C小鼠随机分为口服给药组和肌肉注射两组,雌雄各半。每组再随机分为5小组,也雌雄各半。每只小鼠右腋皮下接种1×106个H22肝癌细胞以制备肝癌小鼠模型。radinbitor的治疗剂量分别为0.5mg/kg体重、1.25mg/kg体重和5mg/kg体重,阴性对照组给予生理盐水(0.2ml/kg体重),阳性对照组给予重组人血管内皮抑素(1.65mg/kg体重)。每天给药一次。实验第21天处死动物,取瘤称重。镜下观察HE染色的肿瘤组织切片,并计数血管数量。结果：radinbitor在*** BL21中得到高表达。通过His-BindColumn亲和层析获得大量纯化的radinbitor蛋白。动物实验显示,与生理盐水阴性对照组相比,纯化的radinbitor各剂量组的瘤重和血管数明显下降,有显著性差异(Pradinbitor对H22肝癌细胞的生长具有明显的抑制作用。同时推测,radinbitor对肿瘤生长的这种抑制作用的机制可能是其抑制肿瘤组织周围血管形成的作用。

关键词： radinbitor 白眉蝮蛇 H22肝癌细胞株肿瘤生长抑制作用

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基因重组蛇源去整合素radinbitor的抗肿瘤生长作用

基因重组蛇源去整合素rAdinbitor的抗肿瘤生长作用

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作者：张益清大连医科大学

学位级别：硕士

目的:研究基因重组蛇源去整合素radinbitor的抗肿瘤生长作用及其抗肿瘤生长的机制,为以后进入临床应用提供必要的实验室依据。方法:本实验由二部分组成,第一部分是利用基因工程手段,将旅顺产白眉蝮蛇去整合素radinbitor的基因在大肠杆菌... 详细信息

目的:研究基因重组蛇源去整合素radinbitor的抗肿瘤生长作用及其抗肿瘤生长的机制,为以后进入临床应用提供必要的实验室依据。方法:本实验由二部分组成,第一部分是利用基因工程手段,将旅顺产白眉蝮蛇去整合素radinbitor的基因在大肠杆菌BL21中表达,并大量培养含有重组蛇源去整合素radinbitor基因的大肠杆菌BL21,超声破碎提取含有radinbitor的总蛋白,(然后)利用His·Tag亲和层析的方法纯化radinbitor。然后,采取小鼠的体内实验,证明radinbitor的抗肿瘤生长作用及其抗肿瘤生长的机制。首先制造C57BL/6小鼠肿瘤模型,我们分别利用了黑色素瘤B16和肺癌LLC两种肿瘤株作为radinbitor的治疗对象,于接种瘤细胞后第二天,以三种不同剂量梯度的radinbitor腹腔注射给药,每天一次,以生理盐水为空白对照,15天后处死小鼠,取瘤,称重,并分别做病理切片观察瘤内血管数量的差异,另外分别取肺组织做病理切片观察肿瘤细胞转移的差异。第二部分是研究radinbitor突变体RI(49)A(50)RGD→RPTRGD对FAK-Ras-MEK通路的影响。结果:我们利用基因工程手段成功获得了大量纯化的radinbitor,得率为3.42mg/L培养液。小鼠体内实验证明, radinbitor剂量分别为0.5mg/kg、1.25mg/kg、5mg/ kg体重小鼠进行治疗后,黑色素B16肿瘤分别被抑制40.0%、78.8%和94.4%;肺癌LLC肿瘤分别被抑制39.6%、71.7%和94.3%。同时,肿瘤的肺转移受到抑制。病理切片显示radinbitor能抑制肿瘤的血管生成。三个剂量组分别抑制黑色素B16肿瘤的血管生成达45.9%、71.6%和91.7%;肺癌瘤株中血管生成分别被抑制达44.0%、70.3%和90.7%。Western印迹实验显示radinbitor突变体RPTRGD具有去整合素特性,对FAK-Ras-MEK通路起负调控作用,表现为神经胶质瘤C6细胞FAK、Ras、MEK1/2和ERK1/2的表达明显降低,而caspase-3的表达明显升高。结论:(1)基因重组蛇源去整合素radinbitor具有典型的去整合素特性,可以抑制血管的生成从而抑制肿瘤的生长。(2) radinbitor突变体RPTRGD仍具有去整合素特性,对神经胶质瘤C6细胞FAK-Ras-MEK信号转导通路起负调控作用,并诱导细胞凋亡。

关键词：白眉蝮蛇去整合素 radinbitor RPTRGD 信号转导

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重组去整合素radinbitor对肝癌细胞H22生长的抑制作用

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中国药房 2014年第9期25卷 790-793页

作者：刘雪梅王冬梅王众田余祥赵宝昌大连医科大学生物化学教研室辽宁大连116044 赤峰学院生物化学教研室内蒙古赤峰024000 大连医科大学七年制2009级辽宁大连116044

目的:探讨源于白眉蝮蛇的重组去整合素radinbitor对肝癌细胞H22生长的抑制作用及其机制。方法:通过诱导重组表达、纯化、鉴定等步骤获得radinbitor;采用右腋皮下注射1×106个H22细胞制备肝癌小鼠模型,随机分为模型组(0.9%氯化钠注射液0.... 详细信息

目的:探讨源于白眉蝮蛇的重组去整合素radinbitor对肝癌细胞H22生长的抑制作用及其机制。方法:通过诱导重组表达、纯化、鉴定等步骤获得radinbitor;采用右腋皮下注射1×106个H22细胞制备肝癌小鼠模型,随机分为模型组(0.9%氯化钠注射液0.2 ml/kg)、阳性对照组(重组人血管内皮抑制素1.65 mg/kg)和高、中、低剂量治疗组(radinbitor 5、1.25、0.5 mg/kg),每组8只,肌肉注射相应药物,每日1次,连续给药3周后处死小鼠,取瘤称质量,镜下观察肿瘤组织切片中5个视野下的血管数量。结果:成功诱导表达并纯化radinbitor,其蛋白含量为1.4 mg/ml,相对分子质量约为9 kD。各组小鼠瘤质量和血管数量分别为模型组:(1.513±0.922)g和3.34±0.58;阳性对照组:(0.562±0.304)g和1.33±0.58;高剂量治疗组:(0.318±0.205)g和1.18±0.56;中剂量治疗组:(0.434±0.323)g和1.32±0.60;低剂量治疗组:(0.536±0.328)g和1.35±0.58。与模型组比较,各剂量治疗组小鼠的瘤质量和血管数量均明显下降(Pradinbitor对H22细胞的生长具有明显的抑制作用,其机制可能是抑制瘤组织周边新血管的形成。

关键词： radinbitor 去整合素肝癌细胞H22 血管新生抑制作用

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CRK在鼠肝癌Hca-P细胞恶性潜能中的作用

CRK在鼠肝癌Hca-P细胞恶性潜能中的作用

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中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议

作者：周赞美孟隆隆孙明忠刘淑清大连医科大学生化教研室大连医科大学生物技术系

目的:过表达CRKI/II及低表达CRKII对Hca-P细胞体外增殖、克隆形成、迁移、侵袭、黏附影响;明确p130cas/CRK/Dock180/Rac1通路中起主导作用CRK成员;研究肿瘤潜在制剂去整合素r Adibitor通过该通路的作用机制。方法:1.构建pc DNA3.1/V5-Hi... 详细信息

目的:过表达CRKI/II及低表达CRKII对Hca-P细胞体外增殖、克隆形成、迁移、侵袭、黏附影响;明确p130cas/CRK/Dock180/Rac1通路中起主导作用CRK成员;研究肿瘤潜在制剂去整合素r Adibitor通过该通路的作用机制。方法:1.构建pc DNA3.1/V5-His B-CRKI过表达载体,稳转Hca-P,获得CRKI稳定上调细胞株,考察CRKI过表

关键词：肝癌 CRKI CRKII Hca-P radinbitor

来源： cnki会议评论

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