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不同来源产单核细胞李斯特菌株对不同环境因子的抗性研究

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不同来源产单核细胞李斯特菌株对不同环境因子的抗性研究

作者：古丽孜帕·夏热浦汗石河子大学

学位级别：硕士

产单核细胞李斯特菌(Listeriaes monocytogenes,LM)是重要的人畜共患病原菌及毒力最强的食源性病原菌,LM的致病性与毒力基因密切相关,缺失毒力基因可以导致其致病性的消失或下降。而不同环境因子作用于LM后是否影响其毒力基因表达,从而... 详细信息

产单核细胞李斯特菌(Listeriaes monocytogenes,LM)是重要的人畜共患病原菌及毒力最强的食源性病原菌,LM的致病性与毒力基因密切相关,缺失毒力基因可以导致其致病性的消失或下降。而不同环境因子作用于LM后是否影响其毒力基因表达,从而丧失其已有的毒力,不同来源分离株LM对不同环境因子的耐受性是否相同等仍不清楚。本研究以食源性LM标准株、绵羊脑炎LM分离株(LM90)及青贮饲草分离株LM(LM19)作为试验菌株,分别采用不同温度、PH值、氯化钠浓度、紫外线进行作用,通过检测LM的生长状态、毒力因子、主要毒力基因的表达情况,以确定不同来源LM分离株对不同环境因子的抗性,为进一步探讨LM的保菌机制、维持致病力机制及食源性LM传播控制提供参考。主要研究内容和结果如下:1、不同来源LM对不同理化因子的抗性采用不同温度、p H、氯化钠浓度、紫外线作用不同来源LM,通过活菌计数和吸光度检测观察细菌生长状况。结果62℃30分钟和72℃30分钟三株LM均生长,其中食源性LM对热抗性最强、LM19最弱,100℃时三株LM均不生长,提示巴氏消毒方法对处理污染LM的食品时存在安全隐患;低温环境4℃/10d、4℃/20d、-20℃/10d和-20℃/20d下LM仍存活,4℃较-20℃更利于LM生长,其中LM19对低温的抗性最强,LM90最弱,提示低温冷藏和冷冻对受LM污染的食品不影响LM的生存活性;不同PH及盐浓度生长试验显示Ph4-10时三株LM均生长良好,ph2-3活菌数很少,其中LM19抗酸性最强,食源性LM最弱,说明食品保存应在保证不影响食品品质的前提下尽可能选酸性条件保存,制备青贮时保持在p H4以下,可控制青贮中LM的生长;在1-7%浓度盐环境中三株LM生长良好,随着盐浓度增大,存活率逐渐下降,其中以LM90的抗盐性最强,在10%以上盐浓度下三株LM趋于不生长,从而间接说明腌制食品受LM污染的风险较小;在紫外线照射时间超过90min时才能完全杀灭LM,其中以LM19的抗性最强。因此,紫外线用于微生物实验超净工作台消毒时,照射时间最好达到90min以上。2、不同来源LM受不同理化因子作用后其毒力因子变化三株LM受温度为-20℃-72℃处理后均出现β溶血现象;pH2-10的环境下,三株LM均出现β溶血圈;在1%-18%盐浓度时三株LM均出现明显β溶血现象;不同时间紫外线照射后,食源性LM和LM90在0-90min均出现溶血现象,LM19在0-60min出现了溶血圈。磷脂酶试验显示,三株LM在-20℃-72℃温度下、p H2-10及1%-18%盐浓度时三株LM周边均出现乳白色晕圈现象,显酶活性阳性反应,且圈的大小无明显差异;紫外线照射显示食源性LM和LM90在0-90min时磷脂酶阳性,LM19在0-60min均为阳性。3、不同来源LM受不同理化因子作用后其毒力基因的变化三株LM除在100℃不生长外,其余-20℃-72℃生长的细菌均通过PCR扩增出hly毒力基因目的片段(743bp)和prf A毒力基因目的片段(715bp);在p H2-10生长的细菌均通过PCR扩增出hly和prf A毒力基因目的片段;盐浓度在1%-18%下生长的细菌均通过PCR扩增出hly和prf A毒力基因目的片段,紫外线照射后均通过PCR检测到hly和prf A毒力基因目的片段。上述研究结果表明,不同来源LM在不同理化因子作用后,其生长存活性状与其主要毒力因子溶血素和磷脂酶变化及毒力基因Hly和毒力调控因子Prf A的表达呈一致性,环境因子只能影响其生存活性,不影响其毒力;从而推出环境因子能影响其生存活性,但对毒力基因Hly和毒力调控因子Prf A影响不大;不同来源LM对不同理化因子的抗性差异不明显。研究结果进一步论证了LM对多种理化因子有很强的抗性及容易造成食品污染的风险。

关键词：产单核细胞李斯特菌环境因子磷脂酶 prfa hly

单核细胞增生李斯特菌毒力相关基因的筛选鉴定及其功能研究

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单核细胞增生李斯特菌毒力相关基因的筛选鉴定及其功能研究

作者：蔡雪薛扬州大学

学位级别：硕士

据世界卫生组织(WHO)于2015年统计结果显示,全球每年发生食源性疾病的病例数超过60亿人次,平均每10个人中就有一例感染,导致42万人死亡,食源性疾病已成为当今世界重大的公共卫生问题。由单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm... 详细信息

据世界卫生组织(WHO)于2015年统计结果显示,全球每年发生食源性疾病的病例数超过60亿人次,平均每10个人中就有一例感染,导致42万人死亡,食源性疾病已成为当今世界重大的公共卫生问题。由单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)、沙门菌(Salmonellaspp.)和大肠杆菌(Escherichia coli)等病原细菌引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。其中Lm引起的李斯特菌病具有高致死率的特点,早在2000年就已被WHO列入重点检测的食源性致病菌之一。Lm作为兼性胞内寄生的革兰阳性杆菌,在自然环境中广泛分布,随被污染的食物进入肠道后,可引发胃肠炎、脑膜炎、流产等临床症状。深入研究Lm的致病机理,获得与致病性相关的毒力因子和分子标识,对李斯特菌病的预防控制具有重要的意义。Lm体内致病相关毒力基因的挖掘及功能研究是揭示其致病机制的有效方法,其与宿主细胞相互作用的过程中,能根据所遇到的不同生境,随时调整多个毒力基因的表达模式,从而使细菌可在宿主中适应性生存。由于病原菌与宿主互作是一个多因子作用的复杂过程,目前对其致病性的研究已逐渐从过去对单个基因的功能研究,转变为从整体水平分析宿主和病原菌的相互作用。而转座突变技术已成为发现新基因、发掘已知基因新功能的有效途径之一,有利于我们开展高通量地体内致病毒力基因的筛选。本研究对强毒株Lm XYSN进行了比较基因组学分析,对毒力调控因子prfa特有氨基酸突变以及新基因组岛8的功能进行了探究;另外,利用转座突变技术建立LmXYSN突变体文库,以人结肠癌上皮细胞为筛选模型,进行毒力相关基因的全基因组水平高通量筛选、鉴定与功能研究。LmXYSN毒力相关基因的挖掘及功能的解析,有利于揭示其在宿主体内适应生存的机制,为李斯特菌病的预防与控制奠定理论基础。1、LmXYSNprfa氨基酸替换突变株的构建及生物学特性研究对31株李斯特菌毒力调控因子prfa的比较分析显示,Lm XYSN prfa蛋白存在两处氨基酸自然突变Lys1OAsn以及Thr151A1a。利用PyMOL软件对突变位点的氨基酸进行分析,发现位于第10位氨基酸突变改变了蛋白表面的电子分布,而第151位氨基酸突变位点则是位于prfa变构活化热点区。由此提示,毒力调控因子prfa氨基酸的自然突变可能影响到其调控作用,从而对LmXYSN的体内致病特性产生影响。为了研究prfa的自然突变对Lm XYSN毒力的影响,利用同源重组技术分别构建了prfa缺失突变株Lm XYSNΔprfa以及第10位和151位氨基酸突变回复菌株Lm XYSN prfa10K/1511T。生物学特性测定结果显示,突变株及回复株在BHI培养基中的生长能力与野生菌株一致,氨基酸替换回复突变株的溶血活性也与野生株的相同。RT-PCR检测细菌感染细胞过程中毒力岛1(LIPI-1)中基因的转录表达水平,结果显示XYSNprfa氨基酸突变后,其mRNA表达水平比野生株降低一倍,actA、hly、plcA以及mpl转录水平显著降低,提示Lm XYSNprfa的自然突变增强了对LIPI-1中基因的调控能力。以非吞噬细胞系Caco-2 BBE以及HeLa细胞系为体外感染模型的测定结果表明,Lm XYSN prfa氨基酸的自然突变显著提高了细菌对Caco-2 BBE的增殖能力以及HeLa感染的黏附、侵袭以及增殖能力;而以小鼠口服感染测定的LD50结果表明,回复菌株LmXYSNprfa10K/151T毒力比野生株降低7.34倍。上述实验结果提示,Lm XYSN prfa蛋白第10位和151位氨基酸突变提高了prfa自身转录水平以及对LIPI-1中基因的转录表达水平,增强了Lm XYSN对非吞噬细胞的黏附侵袭能力,影响了细菌在宿主体内的致病能力。2、Lm XYSN基因组岛8突变株的构建及生物学特性研究对基因组岛8内分布的基因比对分析,选择与其它李斯特菌同源性较低的基因簇(XYSN0819、XYSN0820、XYSN0821和XYSN0822)进行功能的初步研究。采用同源重组技术对该基因簇进行敲除,并对LmXYSN ΔXYSN0819-0822不同条件下的生长能力以及不同温度下生物被膜的形成能力进行了测定。结果表明,突变株Lm XYSNΔXYSN0819-0822在BHI培养基和MEM培养中生长速率均显著低于野生株(P<0.05),耐受1%Triton的能力显著弱于野生株(P<0.05),且在37℃和42℃形成生物被膜的能力也显著下降(P<0.05;P<0.01)。以细胞系Caco-2 BBE、HeLa为体外感染模型、BABL/c小鼠为体内感染模型,对XYSNN819-0822缺失株的侵袭能力、小鼠致病能力进行测定。结果表明,XYSN.0819-0

关键词：单核细胞增生李斯特菌毒力因子基因组岛 prfa 转座突变文库 Caco-2BBE

单核细胞增生李斯特菌HNB-LAMP检测方法的建立

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单核细胞增生李斯特菌HNB-LAMP检测方法的建立

作者：张超华中农业大学

学位级别：硕士

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是李斯特菌属中唯一对人致病的胞内寄生菌,能引起老人、孕妇等免疫力低下人群严重的胃肠道、全身系统性和中枢神经系统的食源性感染,是一种世界公共卫生领域重要的食源性病原菌。2005年... 详细信息

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是李斯特菌属中唯一对人致病的胞内寄生菌,能引起老人、孕妇等免疫力低下人群严重的胃肠道、全身系统性和中枢神经系统的食源性感染,是一种世界公共卫生领域重要的食源性病原菌。2005年-2013年国内外LM污染事件不断频发,因此需要建立快速准确的LM检测方法。本研究选取LM的正向转录调控因子A (prfa)基因为靶基因,建立了LM的PCR和HNB-LAMP检测方法。***的prfa基因的克隆分析根据GenBank中收录的LM的prfa基因序列,应用分子生物学软件Primer Premier 5.0设计特异性引物来扩增目的基因。测序分析显示LM模式菌株和临床分离菌株的prfa基因与LML312等菌株的prfa基因均具有99%的核苷酸同源性。***法和HNB-LAMP法的建立设计引物并通过优化反应体系和反应条件建立了PCR和LAMP检测方法。在LAMP反应体系中加入显色剂羟基萘酚蓝(HNB)建立了阳性显天蓝色、阴性显紫罗兰色,可目视结果的HNB-LAMP法。特异性和灵敏度试验结果表明本研究建立的PCR方法和HNB-LAMP方法均能快速准确检测出LM模式菌株和临床分离株,而对EHEC O157:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等食源性病原菌的检测结果均为阴性。***法和HNB-LAMP法的初步应用1mL浓度为4.5CFU/mL菌液人工污染猪肉样品,经增菌培养16h后PCR法可检出LM,经增菌培养8h后LAMP法可检出LM。用国标法检测采集的200份临床冷鲜猪肉样品,分离的51株LM疑似菌株只有3株为LM阳性,48株阴性为非LM李斯特菌,LM的阳性率达1.5%。同时PCR法和HNB-LAMP法检出的LM阳性菌株与国标法分离检出的LM阳性菌株一致,检测结果符合率达100%。

关键词：单核细胞增生李斯特菌 prfa PCR LAMP HNB 检测

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经皮与开腹射频治疗肝癌的合理选择

临床外科杂志 2001年第6期9卷 373-375页

作者：李祝应沈世强张训臣王卫星武汉大学人民医院普通外科 430060

目的　探讨射频 (RFA)治疗肝癌不同途径的合理选用。方法　 41例肝癌病人分为 2组进行经皮射频 (prfa)治疗和开腹射频 (IRFA )治疗 ,并对结果进行比较。结果　prfa治疗 18例病人共 32个肿瘤结节 ,IRFA治疗 2 3例病人共 43个结节 ,prfa和... 详细信息

目的　探讨射频 (RFA)治疗肝癌不同途径的合理选用。方法　 41例肝癌病人分为 2组进行经皮射频 (prfa)治疗和开腹射频 (IRFA )治疗 ,并对结果进行比较。结果　prfa治疗 18例病人共 32个肿瘤结节 ,IRFA治疗 2 3例病人共 43个结节 ,prfa和IRFA并发症率分别为 33.3%和 4.3% (P prfa组 7个病灶复发 ( 4个病人 ) ,复发率 2 1.9% ( 7/32 ) ,而IRFA组仅 1个结节复发 ,复发率 2 .3% ( 1/43,P prfa。

关键词：肝癌射频治疗 prfa IRFA

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经皮肝穿刺射频热凝治疗肝脏恶性肿瘤

中华外科杂志 2001年第10期39卷 749-752,T001页

作者：张智坚吴孟超陈汉陈夷郭佳第二军医大学东方肝胆外科医院上海200438

目的　探讨经皮肝穿刺射频热凝治疗肝癌的意义、适应证和疗效评价标准。　方法1999年 10月～ 2 0 0 0年 10月 ,10 0例肝脏恶性肿瘤患者进行了B超引导经皮肝穿刺射频热凝治疗。患者治疗后每个月进行血清肿瘤标记物检测、B超检查 ,治疗后 ... 详细信息

目的　探讨经皮肝穿刺射频热凝治疗肝癌的意义、适应证和疗效评价标准。　方法1999年 10月～ 2 0 0 0年 10月 ,10 0例肝脏恶性肿瘤患者进行了B超引导经皮肝穿刺射频热凝治疗。患者治疗后每个月进行血清肿瘤标记物检测、B超检查 ,治疗后 1个月复查MRI。　结果　患者肝功能ChildA级 6 7例 ,ChildB级 2 9例 ,ChildC级 4例。原发性肝癌 76例 ,转移性肝癌 2 4例。小肝癌 (未手术 ,肿瘤直径≤ 5cm)甲胎蛋白阳性者治疗后甲胎蛋白转阴占 75 0 % (2 1 2 8) ,明显下降占 2 1 4% (6 2 8)。B超复查肿瘤缩小、MRI或CT提示≤ 5cm肿瘤完全凝固性坏死率 85 9% (6 1 71)。　结论　经皮肝穿刺射频热凝 (prfa)作为肿瘤透热治疗的一种方法 ,对于小肝癌尤其是无手术指征 ,或有手术指征但位于肝中央区、临近腔静脉或肝门区的小肝癌 ,是一种微创、时间短、安全方便、疗效可靠的新方法。对于大肝癌 ,prfa可与肝动脉介入化疗栓塞联合应用 ,提高疗效。

关键词：肝肿瘤电外科手术射频治疗电凝法适应证 prfa

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肝癌合并糖尿病射频术后并发肝脓肿的护理

中国实用护理杂志 2006年第1期22卷 24-25页

作者：盛月红第二军医大学东方肝胆外科医院上海200438

肝癌的射频热凝(prfa)治疗由于其创伤小、恢复快等优点为多数患者所接受.但随着临床上肝癌合并精尿病患者的不断增多,两病并存,使患者的病情更为复杂,增加了射频治疗的危险性[1].我科1999年10月-2005年3月为50例肝癌合并糖尿病患者行射... 详细信息

肝癌的射频热凝(prfa)治疗由于其创伤小、恢复快等优点为多数患者所接受.但随着临床上肝癌合并精尿病患者的不断增多,两病并存,使患者的病情更为复杂,增加了射频治疗的危险性[1].我科1999年10月-2005年3月为50例肝癌合并糖尿病患者行射频热凝治疗,术后并发肝脓肿6例,现报道如下。

关键词：肝癌合并糖尿病患者射频热凝治疗术后并发肝脓肿护理射频治疗 prfa

超声引导经皮射频消融微创治疗老年小肝癌体会

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实用老年医学 2008年第6期22卷 471-472页

作者：陆军王勇超中国南方航空医学鉴定中心普外科广东省广州市510406

近年来国内外学者先后开展了许多微创性的局部治疗方法,其中多电极射频消融(percutaneous radiofrequency ablatio,prfa)治疗肝癌已成为新的热点[1].我院普外科和超声科合作把prfa集中应用于小肝癌的非手术微创治疗中,取得了较为理想的... 详细信息

近年来国内外学者先后开展了许多微创性的局部治疗方法,其中多电极射频消融(percutaneous radiofrequency ablatio,prfa)治疗肝癌已成为新的热点[1].我院普外科和超声科合作把prfa集中应用于小肝癌的非手术微创治疗中,取得了较为理想的疗效.现报道如下.

关键词：微创治疗小肝癌经皮射频消融超声引导多电极射频消融老年治疗方法 prfa

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大肝癌的外科循证治疗

消化肿瘤杂志（电子版） 2011年第2期3卷 67-69页

作者：谢峰杨甲梅第二军医大学附属东方肝胆外科医院上海200438

原发性肝细胞癌是常见的恶性肿瘤之一,全世界每年新患肝癌者约62.6万例.死亡59.8万例[1],在我国发病人数居首位,年死亡数多达33万例左右,死亡率在各种恶性肿瘤中居第二位[2].由于其早期症状隐匿,大多数患者就诊时已属中晚期.

关键词：大肝癌 cm 手术切除肿瘤直径外科治疗 TACE 肝癌患者 prfa

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经皮肝穿刺射频热凝治疗肝癌

第二军医大学学报 2001年第7期22卷 669-671页

作者：张智坚吴孟超陈汉陈夷郭佳第二军医大学东方肝胆外科医院超声介入科上海200438

目的 :探讨 B超引导经皮肝穿刺射频热凝 (prfa)治疗肝癌的价值。方法 :对 77例肝癌患者进行 B超引导 prfa治疗。患者肝功能分级 Child A级 5 9例 ,B级 16例 ,C级 2例。原发性肝癌 5 9例 ,继发性肝癌 18例。患者治疗后每个月进行AFP和 ... 详细信息

目的 :探讨 B超引导经皮肝穿刺射频热凝 (prfa)治疗肝癌的价值。方法 :对 77例肝癌患者进行 B超引导 prfa治疗。患者肝功能分级 Child A级 5 9例 ,B级 16例 ,C级 2例。原发性肝癌 5 9例 ,继发性肝癌 18例。患者治疗后每个月进行AFP和 B超检查 ,治疗后 1个月复查 MRI或 CT。结果 :小肝癌各组 (Child A、B、C) prfa术后 9个月生存率分别为 93.3%、90 %和 0。大肝癌各组 (原发、复发、继发 )术后 9个月生存率分别为 5 5 .6 %、2 2 .2 %和 2 5 %。未手术的原发性小肝癌 (≤ 5 cm)2 4例 ,其中 AFP阳性 18例 ,prfa术后 AFP转阴者占 72 .2 % (13/18) ,明显降低者占 2 2 .2 % (4/18) ,未降低者占 5 .6 %(1/18) ;MRI显示 2 4例中肿瘤完全凝固性坏死占 79.2 % (19/2 4)。结论 :prfa作为肿瘤局部透热治疗的一种方法 ,对于小肝癌尤其是无手术指征 ,或有手术指征但手术风险大的小肝癌 ,具有微创、时间短、安全方便、疗效可靠的优点。对于大肝癌 ,prfa可与肝动脉介入化疗栓塞联合应用 ,提高疗效。

关键词：肝肿瘤外科学射频电凝法 prfa