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高效聚磷菌的筛选、鉴定及AJ-3、MK-6菌株污水除磷条件优化

高效聚磷菌的筛选、鉴定及AJ-3、MK-6菌株污水除磷条件优化

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作者：谢祥聪浙江师范大学

学位级别：硕士

富营养化会对水体环境产生恶劣的影响,如降低其透明度,产生有害物质,减少水体中溶解氧量,造成水生生物死亡并破坏水体中生物多样性,影响人、畜的健康及旅游和航运,增加水体治理的成本等。从2010年到2013年水质监测结果表明,我国水体富... 详细信息

富营养化会对水体环境产生恶劣的影响,如降低其透明度,产生有害物质,减少水体中溶解氧量,造成水生生物死亡并破坏水体中生物多样性,影响人、畜的健康及旅游和航运,增加水体治理的成本等。从2010年到2013年水质监测结果表明,我国水体富营养化比较严重,且从监测结果显示的主要污染指标中,均含有导致富营养化关键的因素,即磷这一污染指标。所以当前最有效的限磷防治富营养化的方法之一,是通过除磷工艺等方式降低生活污水、工业污水、农业污水中磷等元素的含有量。目前,相比较如化学污水除磷等工艺,以聚磷菌为除磷执行者的生物除磷工艺拥有化学药剂用量较少、相对运行费用不高等特点。因此,筛选具有高效聚磷能力的聚磷菌,对扩大聚磷菌菌种库,降低工业、生活等污水磷含量,提高水质,具有实际意义。本实验从环境中筛选高效聚磷菌株,并鉴定了筛选所得高效聚磷菌株的种属,研究了其生长及除磷特性。具体结果如下：1. phou基因已经突变的高效聚磷菌的筛选phou基因发生突变是菌株聚磷能力提高的重要因素之一。实验利用phou基因发生突变的菌株在含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯的限磷和富磷固体培养基上均能够将5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯水解而被染色的机理,结合测定菌株在有氧条件下对合成污水的去磷能力的方法,筛选phou基因突变且具有高效聚磷能力的菌株。实验共筛得21株phou基因突变菌株,再将这些菌株于合成污水中进行好氧培养并测定其对合成污水的去磷能力,发现AJ-3、MK-6菌株的去磷率分别是48.0%、40.7%,明显高于其它19株菌株,最终确定AJ-3、MK-6菌株为高效聚磷菌株。2.高效聚磷菌AJ-3、MK-6菌株的鉴定通过鉴定AJ-3、MK-6菌株的菌落和细胞形态以及生理生化特性,并结合对16S rDNA基因序列的测序和blast比对,鉴定AJ-3、MK-6菌株分别为约翰逊不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)和解角质素微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)。3.约翰逊不动杆菌AJ-3、解角质素微杆菌MK-6除磷条件的研究通过研究初始pH、装液量、培养温度、培养转速、接种量、醋酸钠浓度、铜离子浓度、铅离子浓度、钾离子浓度对约翰逊不动杆菌AJ-3、解角质素微杆菌MK-6生长、除磷的影响。优化后结果表明：(1)以接种量为1%、初始pH为8.0、装液量为40.0mL,醋酸钠浓度为1400 mg/L(原为677 mg/L),其它成分未变的改良后的合成污水作为实验组,在培养温度和转速分别是30 ℃、210 r/min的条件下,进行好氧培养9 h,约翰逊不动杆菌AJ-3对合成污水(P043--p浓度为14.9 mg/L)的去磷率达到90.93%,比对照组去磷率提高了35.50%;(2)以醋酸钠浓度为600 mg/L(原为677 mg/L),铜离子浓度为1.00 mg/L,钾离子浓度为30mg/L,铅离子浓度为0.50 mg/L,初始pH为6.0,装液量为40.0 mL,其它成分未变的改良后的合成污水作为实验组,接种10%的种子液,在培养温度和转速分别是30 ℃、220r/min的条件下,进行好氧培养20 h,解角质素微杆菌MK-6对合成污水(PO43--p浓度为14.9 mg/L)的去磷率达到70.81%,比对照组去磷率提高了36.95%。

关键词：聚磷菌 phou基因约翰逊不动杆菌AJ-3 解角质素微杆菌MK-6

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Pseudomonas putida GM6聚磷相关基因的克隆和特性研究

Pseudomonas putida GM6聚磷相关基因的克隆和特性研究

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作者：管莉菠南京农业大学

学位级别：硕士

水体富营养化是全球十大环境问题之一。氮磷尤其是磷的输入是引起水体富营养化的关键因素。城镇生活污水的排放是水体磷污染的主要来源之一。为解决磷污染所带来的危害，在污水进入水体前进行有效处理，降低排放污水的磷浓度十分必要。... 详细信息

水体富营养化是全球十大环境问题之一。氮磷尤其是磷的输入是引起水体富营养化的关键因素。城镇生活污水的排放是水体磷污染的主要来源之一。为解决磷污染所带来的危害，在污水进入水体前进行有效处理，降低排放污水的磷浓度十分必要。目前世界各地大规模污水处理厂主要采用强化生物除磷工艺(Enhanced biological phosphorus removal，EBPR)，EBPR工艺具有污泥产生量少、不使用化学物质和运行经济等特征。在EBPR系统中聚磷菌在磷的去除中起着至关重要的作用。为此，加大对聚磷菌的聚磷特性、聚磷相关基因及聚磷菌的工程化应用进行研究十分必要。本文以高效聚磷菌聚磷机理研究为主线，以高效聚磷菌GM6为研究材料，系统研究了高效聚磷菌的几个与聚磷相关的ppk基因、ppx基因、phou基因和phaZ基因等。通过对这些基因进行克隆、表达和敲除失活来研究菌株在强化废水生物除磷工艺中的作用，取得了大量关于污水强化生物除磷菌基因调控过程的基础研究成果。一．Pseudomonas putida GM6的ppk基因的克隆和敲除以及除磷特性研究运用SEFA-PCR的方法，从GM6中扩增出多聚磷酸盐激酶基因(ppk)，预测其全长为2220 bps，氨基酸水平比对发现与Pseudomonas putida KT2440的同源性为89％，Pseudomonas aeruginosa PAO1为80％，Acinetobacter ***1为58％，Escherichia coli K12-MG1655为33％。通过构建同源重组载体，经两次同源重组获得了失去中间约1 000bps的ppk突变株。将突变株和原始菌株分别接入低磷培养基和合成废水中进行好氧培养。发现在同等初始OD值下，单位干重菌株所吸收的磷在重量上并无显著差异;而当初始OD值不相等时，OD值越大每毫克细胞干重所吸收的磷反而越少。用poly-P染色法对处于好氧培养状态的突变株和原始菌株分别染色，结果发现在同等的条件下，用染色方法无法观察到突变株菌体内有poly-P的存在，而却能在原始菌株中观察到。由于ppk基因参与催化合成长链多聚磷酸盐的，由第二个ppk基因(ppk2)来催化合成的短链多聚磷酸盐在胞内磷酸盐积累过程中可能也发挥着重要的作用。二．Pseudomonas putida GM6的ppx基因的克隆和敲除以及除磷特性研究根据克隆ppk基因的方法从GM6中克隆到它的下游基因序列多聚磷酸酯酶基因(ppx)，该基因与ppk基因的转录方向相反。ppx长为1500 bps，编码500个氨基酸，以ATG作为起始密码子，UGA作为终止密码子。发现其氨基酸与Pseudomonas fluorescensPfO-1的同源性为88％，*** KT2440为84％，Pseudomonas syringae ***728a为83％。根据敲除ppk基因的方法设计两同源臂，最后获得失去中间约500 bps的ppx突变株。将突变株和原始菌株分别接入低磷培养基和合成废水中进行好氧培养。结果发现，初始OD值相等时每毫克细胞干重所吸收的磷含量基本无差别，除磷效率并无明显差异，生长幅度也基本相同;但是，当初始OD值不相等时，每毫克细胞干重所吸收的磷含量与初始OD值的大小成反比。通过poly-P染色后发现，原始菌株和突变株均能观察到poly-P的存在，而用染色方法观察到的poly-P应该是长链的。我们从厌氧释磷实验中发现两种菌做成切片后也能在细胞中观察到较大的PHA颗粒，突变株中的颗粒少于原始菌株，且两菌株在单位时间内的释磷量和PHAs／MLSS值均成正比，但突变株的释磷量明显少于原始菌株，菌体合成的PHAs量占菌体干重的比例也低于原始菌株。这些结果表明，菌株GM6中可能还存在第二个ppx基因(ppx2)，它同样能催化poly-P降解成正磷酸盐，而且ppx2可能是一个水解短链poly-P的功能性基因。三．GM6 phou基因的克隆、KT2440 phou基因的表达和敲除以及碱性磷酸酯酶的反应动力学特性研究根据ppk基因敲除方法，获得了KT2440的phou突变菌株。将突变株和原始菌株分别点接于低磷和高磷MOPS(X-Pi)的平板上，结果发现突变株在高磷平板上由原来的白斑变成了蓝斑。这表明菌株KT2440在失去phou基因功能后，碱性磷酸酯酶能在高磷平板上表达了，这一结果证明了phou在磷转运系统中是一个负调控蛋白。通过测定原始菌株和突变株的生长值和碱性磷酸酯酶活力，发现突变株在LB培养基上的长势没有原始菌株好;根据磷酸苯二钠测定方法，突变株在这两种培养基上的酶活均高于原始菌株。然后从KT2440中扩增基因簇pstSCAB-phou，构建表达载体，转入GM6中得到表达菌株。但

关键词：高效聚磷菌 ppk基因 ppx基因 phou基因 phaZ基因厌氧释磷强化生物除磷

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