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集约化茶园种植生态化学计量特征及微生物养分限制

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集约化茶园种植生态化学计量特征及微生物养分限制

作者：易杰华中农业大学

学位级别：硕士

茶园种植是常见的集约化农业种植模式,可充分利用有限的土壤资源生产出更多农产品。集约化茶园种植在满足农产品需求的同时,高强度种植也带来严重的环境问题,例如:随着氮肥和农药的施用不断加大,肥料的利用率不断下降,病原体产生抗药性... 详细信息

茶园种植是常见的集约化农业种植模式,可充分利用有限的土壤资源生产出更多农产品。集约化茶园种植在满足农产品需求的同时,高强度种植也带来严重的环境问题,例如:随着氮肥和农药的施用不断加大,肥料的利用率不断下降,病原体产生抗药性,导致茶园土壤酸化、氮磷元素失衡、生态系统稳定性降低、土壤微生物多样性下降,最终给生态环境造成破坏。目前关于集约化植茶的研究多集中在土壤养分、茶叶品质、种植技术等方面,而对茶园种植过程中的化学计量、微生物特性并不清楚,这给茶园生态系统的养分循环、可持续利用带来挑战。因此,本论文从集约化茶园种植的生态化学计量角度出发,研究生态化学计量特征及影响因素;以农地和自然林地土壤作对比,探讨植茶过程中土壤微生物养分限制状况及影响因素、土壤磷组分及其溶磷微生物变化特征与影响因素。这些工作的开展为集约化农业生产中微生物多样性和磷有效性的提高提供理论依据。主要结论如下:（1）茶园生态系统中土壤微生物组分化学计量处于弱稳态。土壤C:N保持在8.3-11.25之间,p H、纬度、凋落物养分是影响土壤碳氮磷化学计量特征的主要因子。微生物生物量碳氮远低于其他生态系统,凋落物养分及计量比、p H是影响微生物量碳氮磷化学计量特征的主要因子。凋落物组分中,p H、经度、纬度是影响凋落物碳氮磷化学计量特征的主要因子。海拔与土壤养分及计量比是影响绿色叶片碳氮磷化学计量特征的主要因子。内稳态结果分析表明,微生物组分处于弱稳态。（2）土地利用方式和土壤酸化显著影响土壤胞外酶计量特征。三种不同土地利用方式下的土壤微生物均受到磷限制,与农地和自然林地相比,茶园土壤微生物受到更为严重的磷限制。茶园生态系统中,土壤酸化会加剧土壤微生物对磷的需求;土壤p H、有效养分、微生物量计量和磷循环基因介导土壤微生物磷限制,而p H是介导微生物碳限制的主要因子。自然林地土壤中,p H、土壤有效养分和磷循环基因是影响微生物磷限制的主要因子,土壤养分计量比是影响微生物碳限制的主要因子。（3）土地利用方式和土壤酸化对土壤有机无机磷组分无显著影响。三种土地利用方式下的土壤无机磷组分主要以闭蓄态磷、钙结合态磷和铁结合态磷为主,有机磷组分主要以中等活性有机磷为主。不同土地利用方式下,土壤速效磷、全磷、土壤C:N、土壤C:P、土壤N:P对土壤无机磷组分有显著影响,而土壤全碳、全氮、全磷、速效磷对土壤有机磷组分有显著影响。不同酸化程度下,茶园土壤速效磷、全磷、土壤C:P、土壤N:P对土壤无机磷组分有显著影响,茶园土壤全碳、全磷、全氮对土壤有机磷组分有显著影响。（4）土地利用方式和土壤酸化显著影响土壤编码pho D基因微生物丰度和群落结构。茶园土壤溶磷微生物在纲分类水平下主要为α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、浮霉菌纲（Planctomycetia）、疣微菌纲（Verrucomicrobiae）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）,自然林地土壤溶磷微生物主要以α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、浮霉菌纲（Planctomycetia）为主,农地土壤溶磷微生物主要为α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、浮霉菌纲（Planctomycetia）。α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）在微生物群落网络中起主要作用。随着茶园土壤酸化程度的增加,土壤微生物的多样性、及其网络的复杂性和稳定性均显著降低。茶园土壤中,土壤溶磷微生物群落主要受到p H、微生物量碳、碱性磷酸酶（ALP）、pho D和速效磷（AP）的影响;自然林地土壤中,微生物生物量碳（MBC）和AP是影响编码pho D基因的微生物群落的主要因子。茶园和自然林地土壤中均表现为pho D基因丰度和土壤p H是调控ALP酶活性的主要因子。

关键词：集约化种植茶园土壤生态化学计量胞外酶计量微生物磷限制土壤磷组分 phod

Self-induced Secretion Expression of Trehalose Synthase in Bacillus subtilis WB800n

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Agricultural Biotechnology 2019年第2期8卷 216-219,225页

作者： Xihui WANG Hongling LIU Songsen SUI Shaojie YANG Tengfei WANG State Key Laboratory of Biobased Material and Green Papermaking(LBMP) Qilu University of Technology Shandong Key Laboratory of Microbial Engineering Qilu University of Technology Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology(Tianjin University of Science & Technology) Ministry of Education and Tianjin Key Lab of Industrial MicrobiologyTianjin University of Science & Technology Zhucheng Dongxiao Biotechnology Co. Ltd.

Bacillus subtilis is a non-pathogenic Gram-positive bacterium that has been widely used to produce industrially and pharmaceutically relevant proteins. Trehalose, a non reducing disaccharide used as protective agent and additive in foodstuffs and pharmaceutical products, can be prepared by trehalose synthase(TreS). The present work aims to construct a robust recombinant B. subtilis to achieve the secretory expression of TreS. In this study, the treS gene from Pseudomonas putida ATCC47054 was amplified by PCR and further cloned and expressed in B. subtilis WB800 N using pHT01 as expression vector. For avoiding the use of inducer, promoter P_(srfA) was used to replace the promoter P_(grac) in pHT01 and verify the activity of recombinant trehalose synthase. The TreS activity assay was employed to evaluate the performance of recombinant B. subtilis W800 N under different phosphate concentrations, carbon sources, carbon source concentrations, nitrogen sources and pH. The results showed that the P_(srfA) promoter had a good regulation effect under pH 8.0 condition, and the enzyme activity reached 6 000 U/L. Using the phod as the secretory signal peptide, TreS was effectively secreted, and the extracellular enzyme activity reached 2 100 U/L, accounting for 35% of the total enzyme activity. By optimizing the medium and fermentation conditions, the extracellular enzyme activity reached 6 900 U/L in 5 L of fermentor, and the proportion reached 48%. The pHT01-P_(srfA)-phod-treS secretory recombinant B. subtilis constructed in this study has great potential in trehalose synthase production.

关键词： Trehalose synthase Bacillus subtilis W800N P srfA promoter Self-induction phod signal peptide

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蓝细菌磷酸酶基因多样性及其对磷素的响应

蓝细菌磷酸酶基因多样性及其对磷素的响应

作者：赵丹丹华南理工大学

学位级别：硕士

经济的快速发展导致水体富营养化的加剧,给生态环境和人类健康带来了威胁。碱性磷酸酶(APase)是最主要的有机磷水解酶,释放的无机磷供藻类利用,致使藻类大量繁殖,蓝藻细胞中也含有APase,可以降解水中的有机磷供藻细胞生长代谢。本研究... 详细信息

经济的快速发展导致水体富营养化的加剧,给生态环境和人类健康带来了威胁。碱性磷酸酶(APase)是最主要的有机磷水解酶,释放的无机磷供藻类利用,致使藻类大量繁殖,蓝藻细胞中也含有APase,可以降解水中的有机磷供藻细胞生长代谢。本研究中选取了中国淡水藻种库中蓝藻的4个属,共34种不同蓝藻,对其是否含有碱性性磷酸酶基因以及所含有的碱性磷酸酶基因的种类进行初步普查和统计,并以珠江广州段穗石,中大,坦尾,白蚬壳和南沙五个位点的水样为研究对象,利用高通量测序研究了蓝细菌16S r RNA基因和碱性磷酸酶pho X基因的多样性,同时研究了Anabaena flos-aquae FACHB245对磷的响应。得到的主要结论如下:1)对34株蓝藻碱性磷酸酶基因的普查结果显示,淡水藻种库中检测的蓝藻基本都含有一种碱性磷酸酶基因,其中Aulosira FACHB-601,Anabaena cylindrica FACHB-170含有pho X,pho D,pho A三种碱性磷酸酶基因,8株藻含有两种碱性磷酸酶,大部分的藻只含有一种碱性磷酸酶。其中含有碱性磷酸酶pho X的藻株种类较多,有25株,含有碱性磷酸酶pho A的藻株种类较少,共7株,含有碱性磷酸酶pho D的藻株共12株。可以看出pho X在蓝藻中的存在远大于其他两种类型的APase,说明碱性磷酸酶pho X在蓝藻中协调有机磷吸收利用中可能是必不可少的,或者说在水体磷循环中pho X起到了重要的作用。2)以珠江水体为研究对象,分别采集中大(ZD)坦尾(TW)白蚬壳(BXK)南沙(NS)穗石(SS)五个点水样,以蓝藻16S r RNA基因和pho X基因为靶标,扩增回收并进行高通量测序。蓝细菌16S r RNA基因数据表明:五个样品最终得到7814条可用的数列,上述五点16S r RNA基因分别含有74,66,72,90,72个操作分类单元(Operational Taxa Unit,OUT),分析得到微生物群落的alpha多样性指标表示,NS的Simpson指数和Shannon指数均是五个点中最高,TW的Simpson指数和Shannon指数均是五个点中最低,结果表明NS点蓝藻16S r RNA多样性明显高于其他几个取样点,而TW的蓝藻16S r RNA基因多样性在五个点中相对较低。3)高通量分析,碱性磷酸酶pho X数据表明:五个样品的共有10489条可用的数列,分析得到微生物群落的alpha多样性指标表示上述五点pho X分别含有185,205,144,202,210个OTU,NS的Simpson指数和TW的Shannon指数是五个点中最高的,说明这两点微生物多样性高,物种分布最均匀,BXK的Simpson指数和Shannon指数均是五个点钟最低,结果表明NS,TW点pho X蓝细菌丰度明显高于其他几个取样点,而BXK群落丰度在五个点中相对较低。上述五点的环境差异,特别是水质差异,不同的生态环境条件为含pho X细菌的繁殖与进化提供了特有的环境,因此导致微生物的分布存在差异。整体来说,珠江广州段上中下游中含pho X细菌群落差异较小,无明显规律,南沙和坦尾水体含pho X细菌的多样性相对较多。4)不同磷源(无磷,无机磷,有机磷)对Anabaena flos-aquae FACHB245生长和碱性磷酸酶活性的影响:在含无机磷的培养基(BG11)中的培养的藻细胞在整个生长期中碱性磷酸酶的活性都较低,约为0.7±0.22mmol/min/OD600nm。而无磷培养基中,细胞的APase活性一直有较为明显的上升趋势,10天的时候达到最大值24±0.43mmol/min/OD600nm。而有机磷培养基中生长的藻细胞,在培养初期是呈上升趋势,约在培养的第6-8天达到最高值后,活性不会再上升。从碱性磷酸酶的表达量上可以看出,Anabaena flos-aquae FACHB245中pho D和pho X在有机磷培养条件下也具有一定表达水平,而在缺磷培养基中其表达水平显著提高。结果表明,Anabaena flos-aquae FACHB245通过上调碱性磷酸酶活性和表达量来应对磷饥饿胁迫。无机磷最适合该藻的生长,有机磷也能提供Anabaena flos-aquae FACHB245生长的磷源,但细胞需要上调碱性磷酸酶的表达,分解有机磷供细胞生长。

关键词：蓝藻碱性磷酸酶 phoX phoA phod

黑土区玉米和水稻不同种植年限土壤磷库变化及微生物响应研究

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黑土区玉米和水稻不同种植年限土壤磷库变化及微生物响应研究

作者：许璐沈阳师范大学

学位级别：硕士

磷是植物生长必不可缺的营养物质,也是不可再生资源。在农业生产中,外源磷肥施入土壤后作物对其利用率一般仅为10%～25%。土壤磷的有效性受土壤性质、土壤类型、耕作方式、施肥方式等因素的影响。黑土作为具有内在生产力、高肥力的一种... 详细信息

磷是植物生长必不可缺的营养物质,也是不可再生资源。在农业生产中,外源磷肥施入土壤后作物对其利用率一般仅为10%～25%。土壤磷的有效性受土壤性质、土壤类型、耕作方式、施肥方式等因素的影响。黑土作为具有内在生产力、高肥力的一种土壤类型,近年来出现土壤养分降低从而影响粮食生产的现象。目前对黑土的研究多聚焦于物理化学性质的变化,对土壤磷素及其微生物群落和功能基因响应过程的研究相对较少。而在磷的生物地球化学过程中,土壤微生物是关键驱动因素。因此,本研究选取黑土区不同种植类型土壤(旱作、水田)作为研究对象,研究其随着种植年限的增加土壤磷库演变规律及其微生物响应过程。主要研究结果如下:1.针对不同耕作年限玉米种植土壤(旱作土壤),长期磷肥施入导致土壤有效磷(Available-P)和残留态磷(Residual-P)含量均随耕种年限增加显著提高(pphod)结果,发现随着种植年限的增加,微生物群落组成(磷脂脂肪酸PLFAs测定)未发生显著变化,但丛枝菌根真菌(AMF)丰度显著下降(pphod基因的绝对丰度在20 yr达到峰值,10 yr和60 yr相比没有显著变化,但phod基因细菌群落却随着耕种年限的增加表现为:变形菌门(Proteobacteria)相对丰度显著提高(pphod基因细菌群落对土壤磷库变化的影响发现:革兰氏阴性菌(G,正相关),AMF(负相关)和拟无枝酸菌属(Amycolatopsis,负相关)与Primary-P和Residual-P均具有显著相关性。2.针对不同耕作年限水稻种植土壤(稻作土壤),长期磷肥施入导致土壤Available-P、Po、Secondary-P、Primary-P、Residual-P含量均随耕种年限增加显著提高(pphod)结果,发现随着耕作年限的增加,微生物群落丰度均显著提高(pphod基因的绝对丰度显著提高(由1 yr的2.59×10/g提高到35 yr的10.05×10/g,pphod基因细菌群落随着耕种年限的增加表现为:变形菌门相对丰度显著提高(pphod基因细菌群落对土壤磷库变化的影响发现:革兰氏阳性菌(G)和AMF均与Primary-P和Residual-P显著正相关;贪铜菌属和链霉菌属(Streptomyces)与土壤磷库所有组分含量均在不同水平上显著正相关,红色杆菌属和水稻多形单胞菌属(Pleomorphomonas)与土壤磷库各组分均在不同水平上显著负相关。3.比较两种不同耕作类型土壤发现:由于长期施肥,土壤中磷的有效性均显著提高,同时显著增加了Residual-P含量。随着耕作年限的增加,不同于旱地种植,水田由于淹水厌氧环境加速了土壤磷的释放,土壤中Po、Secondary-P、Primary-P含量显著提高,土壤微生物群落丰度及phod基因的绝对丰度显著提高,土壤MBC/MBP显著下降,微生物对土壤磷库的响应从无机磷的固定改变为以有机磷的矿化为主。

关键词：黑土区磷土壤微生物群落长期耕作土壤磷酸酶 phod