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Establishment of Indirect ELISA Method for Detection of penton Protein of Fowl Adenovirus GroupⅠ

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Animal Husbandry and Feed Science 2012年第6期4卷 250-253,257页

作者： LUO Si-si XIE Zhi-xun XIE Zhi-qin LIU Jia-bo PANG Yao-shan DENG Xian-wen XIE Li-ji FAN Qing Guangxi Veterinary Research Institute Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccines and New Technology

[ Objective] To establish an indirect ELISA method which can detect fowl adenovirus group I （FAVI） antibody easily and rapidly. [ Method] The expressed and purified FAVI penton recombinant protein was used to be an antigen, optimized the reaction conditions, and then estab- lished the FAVI indirect penton-ELISA antibody detection method. [ Result] The optimal coating concentration of antigen was 1.5 μg/hole, the opti- mal coating condition was 37℃ 2 h and 4 ℃ overnight; the optimal dilution of serum was 1：100; the optimal working concentration of anti-chicken IgG-HRP was 1：2 000; the positive and negative critical value of ELISA was 0.335. Detected the 100 chicken serum samples by the established penton-ELISA method, the positive rate was 41%. [ Conclusion] Through the study, ~e established penton-ELISA method has a good specificity, sensitivity and reproducibility. And it offers an effective tool for the diagnosis of FAVI, the survey of antibody and epidemiology survey.

关键词： Fowl adenovirus group I penton ELISA

禽腺病毒血清4型fiber-2和penton蛋白亚单位疫苗初步研究及免疫效果评价

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中国兽医学报 2023年第6期43卷 1162-1166,1186页

作者：刘世佳尚宵敏王浩周睿李博硕孙晰瑶韩静静杜恩岐西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

选取禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)JLJ13株的fiber-2和penton蛋白作为保护性抗原,利用SWISS-MODEL网站对fiber-2蛋白空间结构进行模拟,截取其主要功能区fiber-2-Shaft 2替代fiber-2,进行密码子优化后,将fiber-2-Shaft 2和penton蛋白基因序列克隆到pET28a(+)载体上并送至北京天一辉远生物科技有限公司进行基因合成,将合成的质粒分别命名为pET-28a-msyb-fiber-2-Shaft 2和pET-28a-msyb-penton。通过原核表达系统进行蛋白表达并使用镍柱纯化。经BCA定量后,用PBS分别将fiber-2-Shaft 2和penton蛋白质量浓度稀释至1000,500,250 mg/L,再将相同质量浓度的fiber-2-Shaft 2和penton蛋白按1∶1体积比混合后作为抗原,配伍ISCOMs佐剂,0.2 mL/只免疫30日龄SPF鸡,即高剂量组免疫fiber-2-Shaft 2和penton蛋白各100μg、中剂量组各50μg、低剂量组各25μg。一免后14 d进行二次免疫,采集二免后7,14,21 d血清检测特异性抗体和中和抗体,并在二免后21 d攻毒。结果显示,成功表达出fiber-2-Shaft 2和penton蛋白,大小分别为69,93 kDa,镍柱纯化后可获得高纯度的蛋白;二免后14 d高中低量组的中和效价依次为1280,640,640,攻毒后阴性对照组表现出明显的临床症状,2~3 d后死亡,疫苗组均未出现任何临床症状。结果表明,利用禽腺病毒血清4型JLJ13株fiber-2-Shaft 2和penton蛋白混合配伍ISCOMs佐剂制备的亚单位疫苗免疫保护效果明显。

关键词：禽腺病毒血清4型 fiber-2 penton 亚单位疫苗免疫效果评价

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Ⅰ群禽腺病毒五邻体基因的克隆及原核表达

广东农业科学 2011年第7期38卷 154-157页

作者：罗思思谢芝勋邓显文刘加波庞耀珊谢志勤谢丽基彭宜广西大学动物科学技术学院广西南宁530005 广西兽医研究所广西南宁530001

根据GenBank中I群禽腺病毒(AAV)基因组序列,设计了1对特异性引物。以CELO毒株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出结构蛋白五邻体基因(penton),将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1的EcoR I和Xho I位点,构建了原核表达载体pGEX-penton。将其转... 详细信息

根据GenBank中I群禽腺病毒(AAV)基因组序列,设计了1对特异性引物。以CELO毒株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出结构蛋白五邻体基因(penton),将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1的EcoR I和Xho I位点,构建了原核表达载体pGEX-penton。将其转化到感受态细胞DH5α中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,获得了45.9 ku的融合蛋白。用不同的IPTG浓度和时间诱导表达,得出诱导的最佳IPTG浓度为1.5 mmol/L,最佳时间为4 h。用尿素提取包涵体表达产物,得到penton纯化蛋白,浓度为2.98 mg/mL。经Western-bolt分析,该蛋白具有良好的反应原性。

关键词： Ⅰ群禽腺病毒克隆 penton 原核表达

TWO NEW FORMULAS FOR TRIANGULATION NUMBER T

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Science China Chemistry 1991年第4期34卷 403-411页

作者：王继科 Harbin Veterinary Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences Harbin 150001 PRC

The present paper reports two [new formulas for calculating triangulation number T.They are T =L^2/l^2 and T = 1.45r^2/l^2, where L is the distance between pentons, l the distancebetween any two adjacent capsomeres, r the radius of viral nucleocapsid. The formulas havebeen verified and applied. It is worth noticing that the triangulation number, viral size anddistance between capsomeres are fully connected by the formula r/(Tl)^(1/2) = 0. 83, and the capsidparameters of all icosahedral viruses are unified in one constant, 0.83.

关键词： icosahedron triangulation number coustant capsomere penton

Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及重组蛋白ELISA鉴别诊断方法的研究

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Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及重组蛋白ELISA鉴别诊断方法的研究

作者：罗思思广西大学

学位级别：硕士

禽腺病毒(FAV)归为腺病毒科禽腺病毒属,根据抗原性差异,分为3个群。I群禽腺病毒(FAVI)具有共同的群抗原,共12个血清型(FAV1-FAV12),在鸡、鸭、鹅体内普遍存在,呈隐性感染,与其他病原共同作用于家禽。2008-2010年从广西南宁市活禽市场采... 详细信息

禽腺病毒(FAV)归为腺病毒科禽腺病毒属,根据抗原性差异,分为3个群。I群禽腺病毒(FAVI)具有共同的群抗原,共12个血清型(FAV1-FAV12),在鸡、鸭、鹅体内普遍存在,呈隐性感染,与其他病原共同作用于家禽。2008-2010年从广西南宁市活禽市场采集259份样品,通过SPF鸡胚传代增殖与PCR鉴定,分离到92份FAV,阳性率为35.5%(92/259)。选取不同年份的8株,进行血凝性、免疫琼脂扩散、形态学、致细胞病变和鸡胚致病性试验。结果显示,8株均不凝集鸡红细胞,能与FAVI阳性血清反应,具有腺病毒粒子的典型特征,致细胞变圆、折光性增强,使鸡胚发育不良。克降8株hexon基因,经序列分析,均与FAVI同源性最高。经遗传进化分析,均与FAVI亲缘关系最近,结果表明,8株分离株为FAVI。根据GenBank中FAVI hexon、penton、100K、33K基因序列,设计引物,经PCR扩增,与pGEX-4T-1载体连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,经IPTG诱导,表明四种重组蛋白得到良好表达;经可溶性分析,表明hexon、penton表达产物以包涵体的形式存在,100K、33K表达产物以可溶性的形式存在;经纯化,表明四种重组蛋白达到了较高的纯度和浓度;经western-blot检测,具有良好的反应原性,可作为间接ELISA的诊断抗原。以hexon和penton结构蛋白分别作为包被抗原,建立检测FAVI抗体的间接hexon-ELISA和penton-ELISA力法。结果农明,抗原最适包被浓度分别为***/mL和15.0ug/mL;一抗血清和最适稀释度均为1：100;酶标二抗最适稀释度均为1：2000;一抗和二抗最适作用时间均分别为75min和45min。两种ELISA方法具有良好的特异性、敏感性、重复性。以不同比例的hexon、penton两种蛋白混合包被,建立hexon-penton-ELISA方法。用三种ELISA方法检测野毒感染和灭活苗免疫血清各30份,结果表明两种血清均有反应,hexon-penton-ELISA灵敏度更高。用三种ELISA方法检测临床样品100份,阳性率分别为45%、41%、48%。为FAVI抗体的检测和流行病学调查提供简便、快速的血清学诊断方法。以100K和33K非结构蛋白分别作为包被抗原,建立检测FAVI抗体的间接100K-ELISA和33K-ELISA方法。结果表明,抗原最适包被浓度分别为10.8u∥mL和12.0u∥mL;一抗血清最适稀释度均为1：100;酶标二抗最适稀释度均为1：3000;一抗和二抗最适作用时间均分别为60min和45min。两种方法具有良好的特异性、敏感性、重复性。以不同比例的100K、33K两种蛋白混合包被,建立间接100K-33K-ELISA方法。J1j三种ELISA方法检测野毒感染和灭活苘免疫『n.消符30份,表明100K-33K-ELISA灵敏度更高。用三种ELISA方法检测临床样l ul 100份,15I…j率分别为40%、35%、42%。该方法可检出FAVI野毒感染血消,而与火活苘免疫血消无反应,为该病的诊断与净化提供技术支撑。

关键词： Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定 ELISA hexon penton 100K 33K

安卡拉病亚单位疫苗的初步研究和传染性法氏囊病毒样颗粒的制备

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安卡拉病亚单位疫苗的初步研究和传染性法氏囊病毒样颗粒的制备

作者：张丹华中农业大学

学位级别：硕士

安卡拉病是一种高度接触性传染禽病,主要感染3-6周龄肉鸡,死亡率为20-80%。病鸡突然死亡,解剖死亡鸡可见大量心包积液,肝脏肿大发黄、出血点,脾脏肾脏肿大充血,因此该病又被称为心包积水肝炎综合征。安卡拉病毒属于禽腺病毒科Ⅰ亚群血清... 详细信息

安卡拉病是一种高度接触性传染禽病,主要感染3-6周龄肉鸡,死亡率为20-80%。病鸡突然死亡,解剖死亡鸡可见大量心包积液,肝脏肿大发黄、出血点,脾脏肾脏肿大充血,因此该病又被称为心包积水肝炎综合征。安卡拉病毒属于禽腺病毒科Ⅰ亚群血清4型(FAdV-4),病毒粒子无囊膜仅由核酸和核衣壳组成。该病毒的核衣壳主要由240个Hexon、12个penton和12根Fiber组成。penton和Fiber2(Fiber的头节区)是其重要的免疫原性基因,它们均可与细胞表面的病毒受体结合,在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的一种接触性传染禽病。该病易发于3-6周龄鸡群,可直接导致感染鸡群较高的死亡率,间接导致感染鸡群出现长期、严重的免疫抑制。其主要特征是法氏囊肿胀、出血后迅速萎缩。病鸡的肾脏、脾脏、淋巴结、法氏囊等重要的免疫器官受到严重损害。传染性法氏囊病毒是双链RNA病毒,属于呼肠孤病毒科。IBDV颗粒是30-60nm的20面体立体对称结构。病毒粒子无囊膜,仅由核酸和核衣壳组成。病毒核衣壳的外壳几乎均由VP2蛋白组成,VP2蛋白是IBDV重要的的结构蛋白和功能蛋白。同时,VP2基因也是IBDV的主要的免疫原性基因。安卡拉病与传染性法氏囊在易感鸡日龄、发病率、潜伏期、病死率以及对免疫力所造成的重大损害等方面都极其相似。安卡拉病的感染导致免疫系统受到严重损害,而提高鸡群对传染性法氏囊的易感性。传染性法氏囊导致感染鸡群产生长期、严重的免疫抑制而易与安卡拉病毒混合感染。安卡拉病和传染性法氏囊不仅容易混合感染而且会提高鸡群对禽流感、新城疫、传染性贫血病、传染性支气管炎等病毒性疾病和大肠杆菌、沙门氏杆菌、巴氏杆菌等细菌性疾病的易感性。然而目前市场上没有安卡拉病的商业化疫苗,为防治安卡拉病和传染性法氏囊,降低养禽业所遭受的重大损失和危害,本文的主要研究内容如下:***-penton,Ac-Fiber2,Ac-VP2三株重组杆状病毒的构建利用杆状病毒昆虫细胞表达系统,分别将penton,Fiber2基因克隆到pFastBac HTb载体,将VP2基因克隆到pFastBac1载体。得到正确的重组质粒后转化DH1OBac,经四种抗性和蓝白斑筛选得到正确的重组杆粒Bacmid-penton,Bacmid-Fiber2,Bacmid-VP2。分别将三种重组杆粒转染 Sf9细胞,3-5d可观察到明显病变,获得三株重组杆状病毒Ac-penton,Ac-Fiber2,Ac-VP2。***,Fiber2,VP2三种蛋白的表达鉴定及优化和纯化将得到的三株重组毒分别接种健康Sf9细胞,3天后观察到病变,收集样品。利用Western blot和间接免疫荧光实验对penton,Fiber2,VP2三种蛋白的表达进行鉴定,并对蛋白表达条件进行优化摸索出最小接毒剂量。然后,对三种蛋白进行大量的表达和纯化。***,Fiber2相关亚单位疫苗的制备和初步研究将penton,Fiber以及两者的等量混合物分别与佐剂ISA 71 VG按质量比3:7混匀制成疫苗,分别免疫SPF鸡。攻毒实验表明三种疫苗都能对安卡拉病达到100%的保护率。肝脏及心脏的病变观察和组织切片观察均可表明三种疫苗有很好的免疫保护效果。并且三种疫苗都能刺激免疫鸡产生高效持久的抗体,其中以penton蛋白为抗原的疫苗刺激鸡产生的抗体效价最高,保持阳性抗体时间最长。4.传染性法氏囊病毒样颗粒的纯化及电镜观察在Sf9细胞中大量表达VP2蛋白,浓缩细胞样品和培养基上清中的传染性法氏囊病毒样颗粒,然后进行蔗糖密度梯度离心。Western blot实验表明传染性法氏囊病毒样颗粒在蔗糖密度梯度为30%的条带中。取相应条带脱糖处理,负染后,可在电镜下观察到30-60nm,形态完整规则的病毒样颗粒。

关键词：安卡拉病传染性法氏囊 penton Fiber2 VP2 杆状病毒表达系统