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MEN1基因对奶牛乳腺上皮细胞细胞周期调控机制的研究

MEN1基因对奶牛乳腺上皮细胞细胞周期调控机制的研究

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作者：刘学山东农业大学

学位级别：硕士

奶牛的产奶量主要取决于乳腺上皮细胞的数量及其分泌活性,增加乳腺上皮细胞的数量对提高产奶量具有重要意义。MEN1编码menin蛋白,在细胞增殖分裂、细胞周期调控以及转录调节、基因组稳定等过程中发挥重要作用。MEN1基因是多发性内分泌肿... 详细信息

奶牛的产奶量主要取决于乳腺上皮细胞的数量及其分泌活性,增加乳腺上皮细胞的数量对提高产奶量具有重要意义。MEN1编码menin蛋白,在细胞增殖分裂、细胞周期调控以及转录调节、基因组稳定等过程中发挥重要作用。MEN1基因是多发性内分泌肿瘤1型综合征的关键致病基因之一,对于特定组织中细胞的异常增殖起到了诱发的作用。另一方面,MEN1对于机体的正常代谢起着重要的调控作用。乳腺是一个重要的代谢器官。本研究拟探讨menin在奶牛的乳腺组织及其乳腺上皮细胞中的功能。研究发现不同生理阶段的奶牛乳腺组织中MEN1/menin表达存在表达变化,进而通过过表达/RNAi干扰技术,发现奶牛乳腺上皮细胞中MEN1/menin表达变化可以改变细胞的生长和增殖。主要研究结果如下：1.利用RT-PCR、WB、免疫组化方法分别检测不同泌乳阶段的奶牛乳腺组织MEN1/Menin的表达变化。menin蛋白阳性点主要位于乳腺腺泡及乳腺导管的上皮细胞中,不同生理阶段的奶牛乳腺组织中MEN1 mRNA水平存在表达变化,menin蛋白各组之间无差异。2.成功建立了真核细胞奶牛Menin蛋白过表达转染体系。利用基因重组技术,成功构建了真核表达载体pcdna3.1-myc-his-bmenl;将重组载体分别转染奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠成肌细胞(C2C12),分别在24h、48h、72h检测目的基因/蛋白的表达,结果表明在3种细胞中转染24h后过表达效果最好,在MAC-T、CHO、C2C12细胞中menin过表达效率分别达到4.41、5.65、1.93倍。3.将真核表达载体转染MAC-T细胞,结果表明转染组MEN1基因表达显著升高(Pbmen-1/2/324h后,MEN1基因在mRNA和蛋白表达水平相比对照组均最低并达到极显著(P<0.01),干扰效率分别为75%、71%。5.在过量/限量表达menin的条件下,利用CCK-8、流式细胞术和qRT-PCR技术,从不同角度都证明menin可以调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖以及细胞周期。menin过表达对细胞增殖及细胞周期没有显著影响;menin限量表达能显著提高G1期细胞百分比,降低S期百分比(P<0.05),CyclinD3、CyclinB2、CDK6基因的表达显著升高,CyclinD1的表达显著降低(P<0.05)。

关键词： MEN1 过表达限量表达 pcdna3.1-myc-his-bmen1 siRNA 细胞增殖

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