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IRAK1基因ShRNA质粒表达载体的构建与鉴定

IRAK1基因ShRNA质粒表达载体的构建与鉴定

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作者：孟庆萍中国医科大学

学位级别：硕士

目的本研究采用含H1启动子的载体pgpu6/gfp/neo,针对IRAK1基因的短发夹结构RNA(shRNA)构建靶向IRAK1基因特异性shRNA真核表达载体,为今后体外或体内研IRAK1基因在中枢神经系统自身免疫性损伤后的功能修复提供一种有效方法。方法根据pgpu... 详细信息

目的本研究采用含H1启动子的载体pgpu6/gfp/neo,针对IRAK1基因的短发夹结构RNA(shRNA)构建靶向IRAK1基因特异性shRNA真核表达载体,为今后体外或体内研IRAK1基因在中枢神经系统自身免疫性损伤后的功能修复提供一种有效方法。方法根据pgpu6/gfp/neo中H1启动子启动表达siRNA对序列的要求,利用Ambion公司在线siRNA Tatget finder软件(http://***/techlib/misc/ siRNA ***)设计合成shRNA序列。在PCR仪上按照如下程序进行shRNA模板的退火处理：95℃5 min,85℃5 min,75℃5 min,70℃5 min,4℃保存。经酶切处理,pgpu6/gfp/neo载体的线性化及其构建。所得质粒用BamHⅠ、PstⅠ分别酶切鉴定并测序。结果成功构建shRNA真核表达载体模式。pgpu6/gfp/neo分别为含抗性筛选标记neomycin同时可以表达gfp蛋白的RNAi载体,Kanamycin/neo分别代表卡那抗性和新霉素抗性。pgpu6/gfp/neo质粒载体用BamHⅠ, PstⅠ分别酶切电泳鉴定,结果表明,所有质粒均为阳性重组载体,即所设计的shRNA干扰片段确已插入到RNAi载体中。每组选择两个克隆进行测序鉴定,测序鉴定结果重组质粒编码序列插入位置正确,无基因突变,与设计完全一致。结论IRAK1基因重组质粒构建成功,为进一步研究体内外自身免疫性损伤的治疗奠定了实验基础。

关键词： RNA干扰技术 IRAK1 pgpu6/gfp/neo质粒载体

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