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IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pbtr-ctxm的结构基因组学分析

微生物学通报 2019年第1期46卷 139-150页

作者：李曼莉王利君赵亚超蒋昭芳周冬生童贻刚赵宝华河北师范大学生命科学学院河北石家庄050024 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 清华大学附属北京清华长庚医院清华大学临床医学院北京102218

【背景】IncFII-FIA-FIB型质粒广泛存在于肠杆菌科细菌中,介导了许多耐药基因的水平转移,并导致细菌多重耐药问题日益严重。【目的】分析IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pbtr-ctxm的基因组结构,并研究其介导大肠杆菌BTR株的耐药基因水平... 详细信息

【背景】IncFII-FIA-FIB型质粒广泛存在于肠杆菌科细菌中,介导了许多耐药基因的水平转移,并导致细菌多重耐药问题日益严重。【目的】分析IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pbtr-ctxm的基因组结构,并研究其介导大肠杆菌BTR株的耐药基因水平转移机制。【方法】利用PCR进行耐药基因筛查;接合转移和电转化实验验证质粒pbtr-ctxm是否具备自主接合转移的特性;VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪测定相关菌株对抗生素的药物敏感性;构建MatePair文库并进行细菌全基因组高通量测序和质粒结构基因组学分析。【结果】菌株BTR是携带blaNDM-1、blaCTX-M-15、blaTEM、qnrD、qnrS1、mph(A)、erm(B)和tetA(B)等耐药基因的多重耐药大肠杆菌,其中blaCTX-M-15、mph(A)、erm(B)和tet A(B)等耐药基因均位于大小为144 939 bp的质粒p BTR-ctxm (GenBank登录号MF156697)上,该质粒可与菌株BTR内质粒pNDM-BTR接合共转移到受体菌大肠杆菌EC600中。pbtr-ctxm具备IncFII-FIA-FIB型质粒典型的骨架区结构,其多重耐药(Multidrug-resistant,MDR)区由新的复合型转座子Tn6492、Tn2残余、Tn10残余、ISEcp1-blaCTX-M-15-Δorf477转座单元和一些插入序列组成。【结论】pbtr-ctxm中新复合型转座子Tn6492与Tn10残余和ISEcp1-blaCTX-M-15-Δorf477转座单元共同介导大肠杆菌BTR株的多重耐药与耐药基因的水平传播。

关键词：大肠杆菌 IncFII-FIA-FIB型质粒 pbtr-ctxm Tn6492 多重耐药

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多药耐药质粒pbtr-ctxm和pTEM-2262的测序和基因组学分析

多药耐药质粒pBTR-CTXM和pTEM-2262的测序和基因组学分析

引用

作者：李曼莉河北师范大学

学位级别：硕士

多药耐药(Multidrug-resistant,MDR)质粒广泛存在于肠杆菌科细菌中,介导了许多耐药基因的水平转移,并导致细菌多重耐药问题日益严重。本文旨在探究临床分离的多重耐药菌株的耐药表型、其携带的多药耐药质粒的全序结构和接合转移能力,并... 详细信息

多药耐药(Multidrug-resistant,MDR)质粒广泛存在于肠杆菌科细菌中,介导了许多耐药基因的水平转移,并导致细菌多重耐药问题日益严重。本文旨在探究临床分离的多重耐药菌株的耐药表型、其携带的多药耐药质粒的全序结构和接合转移能力,并对相关不相容群质粒的结构特征及其携带的耐药基因相关移动元件进行比较基因组学分析,具体分为两个部分:一是IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pbtr-ctxm的结构基因组学分析,二是携带未知复制子的多药耐药质粒pTEM-2262的比较基因组学分析。第一部分旨在分析IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pbtr-ctxm(GenBank登录号MF156697)的基因组特征,并研究其介导大肠杆菌BTR株的耐药基因水平转移机制。利用接合转移和电转化实验验证质粒pbtr-ctxm是否具备自主接合转移的特性;使用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪测定相关菌株对多种抗生素的药物敏感性;构建Mate Pair文库,并进行细菌全基因组高通量测序和质粒的结构基因组学分析。实验结果表明临床分离菌株BTR的bla、mph(A)、erm(B)和tetA(B)等耐药基因均位于大小为144 939 bp的质粒pbtr-ctxm上。可能是由于接合转移区缺少部分基因,质粒pbtr-ctxm需要在菌株BTR内质粒pNDM-BTR的协助下,共转移到受体菌大肠杆菌EC600中,但可通过电转化进入受体菌大肠杆菌DH5α中,属于可移动质粒。在基因组结构上,质粒pbtr-ctxm含有三个复制子RepFII、RepFIA和RepFIB,属于IncFII-FIA-FIB型质粒,故将第一个完整测序的IncFII-FIA-FIB型质粒pRSB107(GenBank登录号AJ851089)、质粒pbtr-ctxm(本文)和与质粒pbtr-ctxm覆盖度、核酸一致性最高(86%+99%)的质粒pRSB225(GenBank登录号JX127248)纳入基因组学分析。研究发现质粒pbtr-ctxm具备IncFII-FIA-FIB型质粒典型的骨架区结构,其多重耐药区由新复合型转座子Tn6492、Tn2残余、Tn10残余、ISEcp1-bla -Δorf477转座单元和一些插入序列组成。IS26、In54、chrA-orf98转座单元、IS26-mph(A)-mrx-mphR(A)-IS6100转座单元、ΔTn6295和Tn6415通过复杂的转座和同源重组事件形成了一个新的复合型转座子Tn6492。本部分结论是质粒pbtr-ctxm介导了大肠杆菌BTR和电转子BTR-ctxm-DH5α对单环β-内酰胺类、部分头孢菌素类、青霉素类(不含酶抑制剂)、大环内酯类和四环素类等抗生素的耐药性。质粒pbtr-ctxm中Tn10残余、新复合型转座子Tn6492和ISEcp1-bla-Δorf477转座单元共同介导大肠杆菌BTR株的多重耐药以及相关耐药基因的水平传播。IncFII-FIA-FIB型质粒pRSB107、pbtr-ctxm和pRSB225的骨架区中存在两个插入“热点”,即pemK与ahr之间和orf249和orf165之间,可整合不同的外源序列,尤其是含有耐药基因的移动元件,从而促进了耐药基因在不同种属细菌间的水平传播。第二部分旨在分析临床分离株弗氏柠檬酸杆菌2262中属于未知不相容群的多药耐药质粒pTEM-2262(GenBank登录号MG387191)的基因组特征,并探究其携带的两个复制子repA和repB在质粒复制过程中的作用。菌株2262在2016年分离于山东省泰安市中心医院神经内科的一位89岁脑梗死男性患者的尿液标本。多位点序列分型MLST发现菌株2262的序列型为新型171,且携带五个新的管家基因亚型clpX(86)、dnaG(69)、fadD(94)、lysP(80)和mdh(76)。接合转移实验表明携带bla、qnrA1、mph(A)和tet(D)耐药基因的质粒(命名为pTEM-2262)可以从供体菌株2262转移到受体菌大肠杆菌EC600中,验证了质粒pTEM-2262可自主接合转移的特性。药敏实验显示菌株2262和接合子2262-TEM-EC600均对氨苄西林、氨苄青霉素/舒巴坦、哌拉西林、环丙沙星、四环素和庆大霉素耐药。此外,菌株2262对妥布霉素、头孢呋辛、头孢呋辛酯、头孢唑啉、头孢替坦、头孢他啶、头孢吡肟、头孢曲松、亚胺培南、美罗培南、氨曲南、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑和呋喃妥因耐药。构建大片段Mate Pair文库并进行细菌全基因组测序,发现质粒pTEM-2262的核苷酸序列长度为262 833 bp,包含两个未分类的复制子repA和repB。为探究复制子repA和repB在质粒复制过程中的作用,采用无

关键词：多药耐药细菌质粒 pbtr-ctxm pTEM-2262 移动元件耐药基因

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