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肿瘤防治研究 2007年第4期34卷 274-276,318页

作者：匡志鹏谢裕安梁安民罗小玲吴继宁广西医科大学附属肿瘤医院生物治疗研究中心南宁530021

目的构建表达小鼠甲胎蛋白(murine alpha fetoprotein,mAFP)基因的重组腺病毒载体pAd-BM5-gfp-mAFP,并测定其滴度。方法从Hepa1-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增mAFP基因,测序确认后,插入到padbm5-gfp穿梭载... 详细信息

目的构建表达小鼠甲胎蛋白(murine alpha fetoprotein,mAFP)基因的重组腺病毒载体pAd-BM5-gfp-mAFP,并测定其滴度。方法从Hepa1-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增mAFP基因,测序确认后,插入到padbm5-gfp穿梭载体中,双酶切鉴定重组腺病毒载体。线性化重组腺病毒载体与病毒骨架DNA质粒用磷酸钙共沉淀法共转染HEK293A细胞,通过同源重组使腺病毒表达mAFP基因,并在HEK293A细胞中大量扩增含目的基因的重组腺病毒,用TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果成功克隆了小鼠mAFP基因,构建出表达mAFP基因的重组腺病毒载体padbm5-gfp-mAFP,获得了表达mAFP基因的重组腺病毒,病毒滴度达3.2×108PFU/ml。结论本研究成功构建了padbm5-gfp-mAFP载体,获得了高滴度表达mAFP基因的重组腺病毒,为进一步开展肝癌的免疫基因治疗奠定了基础。

关键词： padbm5-gfp 小鼠甲胎蛋白重组腺病毒载体

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重组腺病毒载体padbm5-gfp-hIL-2的构建及病毒滴度测定

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现代肿瘤医学 2009年第5期17卷 814-817页

作者：匡志鹏李安娜罗小玲谢裕安梁安民尚俊英吴继宁广西肿瘤防治研究所广西南宁530021

目的:构建重组腺病毒载体padbm5-gfp-hIL-2,并测定病毒滴度。方法:从Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-2基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglII和PmeI双酶切定向插入到padbm5-gfp腺病毒载体中。通过磷酸... 详细信息

目的:构建重组腺病毒载体padbm5-gfp-hIL-2,并测定病毒滴度。方法:从Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-2基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglII和PmeI双酶切定向插入到padbm5-gfp腺病毒载体中。通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果:成功构建出表达hIL-2基因的重组腺病毒载体(padbm5-gfp-hIL-2),获得了高滴度表达hIL-2基因的重组腺病毒。结论:重组腺病毒表达载体(padbm5-gfp-hIL-2)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肝癌的转基因治疗研究。

关键词： hIL-2 重组腺病毒载体病毒滴度 padbm5-gfp

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IL-2基因转染的CIK细胞联合树突状细胞的抗肝癌实验研究

IL-2基因转染的CIK细胞联合树突状细胞的抗肝癌实验研究

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作者：李安娜广西医科大学

学位级别：硕士

第一部分人IL-2基因克隆及重组padbm5-gfp-IL-2腺病毒载体的构建目的:克隆人白细胞介素2基因(IL-2),构建重组padbm5-gfp-IL-2腺病毒载体。方法:从PHA体外刺激培养的Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,以反转录聚合酶链反应(RT-PCR... 详细信息

第一部分人IL-2基因克隆及重组padbm5-gfp-IL-2腺病毒载体的构建目的:克隆人白细胞介素2基因(IL-2),构建重组padbm5-gfp-IL-2腺病毒载体。方法:从PHA体外刺激培养的Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法制备互补DNA(cDNA)模板,以PCR方法扩增IL-2基因,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆经鉴定后测序,将测序正确的IL-2基因片段用BglⅡ和PmeⅠ双酶切消化回收并纯化后定向插入到padbm5-gfp腺病毒载体中。酶切鉴定后通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,并使用TCID50法测定AdBM5-gfp-IL-2重组腺病毒滴度。结果:采用RT-PCR法克隆出IL-2基因,经基因测序显示克隆的IL-2序列完全正确,全长528bp,含462个碱基开放读框。构建出padbm5-gfp-IL-2真核表达载体。经HEK293A细胞体外扩增,3天后即见绿色荧光蛋白的表达,11天可见噬斑的出现。纯化后的重组腺病毒AdBM5-gfp-IL-2滴度可达5×10PFU/ml。结论:成功构建了含IL-2基因的重组腺病毒表达载体(padbm5-gfp-IL-2),为下一步扩增重组腺病毒开展肝癌的免疫与基因治疗研究奠定基础。第二部分人IL-2转染的CIK细胞联合DC对肝癌细胞的杀伤作用目的:探讨IL-2基因转染的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)联合树突状细胞(DC)对肝癌细胞的杀伤作用。方法:采用密度梯度离心法从健康人外周血中分离单个核细胞(PMBC),分别诱导CIK细胞(培养体系:将分离得到的PMBC置于培养箱培养2小时,收集悬浮细胞,采用抗CD3单克隆抗体50ng/ml、rhIL-21000U/ml、rhIL-1 1000U/ml和IFN-γ1000U/ml联合诱导培养CIK细胞)和DC(培养体系:贴壁细胞经rhIL-4 100ng/ml和rhGM-CSF 100ng/ml诱导培养DC)。用携带IL-2基因的重组腺病毒AdBM5-gfp-IL-2转染CIK细胞(MOI=100),用HepG2肝癌冻融抗原冲击致敏DC(DC与肝癌抗原的比例为1:20),然后将转染IL-2基因的CIK细胞(CIKpIL-2)与肝癌抗原致敏DC(DC-Ag)共培养,制备肝癌抗原致敏DC激活的IL-2基因修饰的CIK细胞(DC-Ag-CIKpIL-2)。采用MTT法检测CIK、DC-CIK、DC-Ag-CIK、DC-CIKpIL-2、DC-Ag-CIKpIL-2对肝癌HepG2细胞的杀伤作用,效靶比分别为10∶1、20∶1、40∶1,同时以肝癌细胞H7404、白血病细胞K562作为靶细胞进行杀伤对照实验。结果:DC-Ag-CIKpIL-2与DC-CIKpIL-2细胞组显示了很强的抗肝癌作用,在效靶比分别为10∶1、20∶1、40∶1时,DC-Ag-CIKpIL-2对HepG2的杀伤活性分别为(37.28%±5.71、50.82%±4.95、62.72%±3.78),DC-CIKpIL-2对HepG2的杀伤活性分别为(35.16%±2.22、42.67%±5.26、59.93%±6.71),均高于CIK(19.14%±3.28、28.14%±2.43、44.23%±5.33)、DC-CIK(47.86%±3.27、32.36%±4.62、22.60%±1.83)、DC-Ag-CIK(51.41%±1.43、35.34%±2.57、22.83%±1.67)对HepG2肝癌细胞的杀伤活性(各组间比较均为P＜0.05);DC-Ag-CIKpIL-2与DC-CIKpIL-2对K562、H7404细胞也显示出较强的杀伤活性。DC-Ag-CIKpIL-2细胞组与DC-CIKpIL-2细胞组的杀瘤活性比较,差异无统计学意义(在效靶比分别为10∶1、20∶1、40∶1时二组间比较P值分别为:0.58、0.12和0.56)。杀瘤作用随着效靶比的增高而增强。结论:经DC激活的IL-2基因转染的CIK细胞具有更强的抗肝癌作用,本实验为CIK细胞治疗肝癌及肝癌的过继免疫治疗提供实验依据,有一定的指导意义。

关键词： IL-2 基因克隆重组腺病毒载体 padbm5-gfp CIK DC 肝癌腺病毒杀瘤作用

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